本文關(guān)鍵詞：腹膜透出液線粒體DNA含量與腹膜功能及腹膜炎預(yù)后關(guān)系的研究

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【摘要】：第一部分透出液線粒體DNA含量與腹腔炎癥狀態(tài)及腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能的關(guān)系研究目的維持性腹膜透析(Peritoneal dialysis,PD)患者腹膜局部長(zhǎng)期處于慢性炎癥狀態(tài),腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能與炎癥程度密切相關(guān)。研究證實(shí)線粒體DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)由受損或死亡細(xì)胞釋放入循環(huán)后可引起炎癥反應(yīng)。mtDNA是否參與了PD患者腹腔慢性炎癥狀態(tài)目前不清楚。本研究旨在探討腹膜透出液中mtDNA與腹腔炎癥狀態(tài)及腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能之間的關(guān)系。方法選取2009年1月1日～2010年12月31日在我院接受開(kāi)始維持性腹膜透析的終末期腎病患者。患者在第一次行腹膜平衡試驗(yàn)(PET)時(shí)留取透出液標(biāo)本,熒光定量PCR法檢測(cè)透出液上清液中mtDNA含量,ELISA法檢測(cè)IL-6、IL-17A、TNF-α和IFN-γ水平。記錄患者基本資料、實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)及生存預(yù)后資料等。應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果符合研究納入標(biāo)準(zhǔn)的共有189例,男性105例,女性84例,平均年齡47.1±13.5歲,中位隨訪時(shí)間為41.9個(gè)月。所有患者平均腹膜溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)率(Peritoneal solute transport rate,PSTR)為 0.66±0.12,其中高轉(zhuǎn)運(yùn) 18(9.5%)例,高平均轉(zhuǎn)運(yùn) 94(49.7%)例,低平均轉(zhuǎn)運(yùn)57(30.2%)例,低轉(zhuǎn)運(yùn)20(10.6%)例。腹膜透出液中位mtDNA含量為 4325 copies/ul,IL-6 濃度為 25.9pg/ml,IL-17A 濃度為 10.8pg/ml,TNF-α 濃度為 25.8pg/ml,IFN-y 濃度為 17.9pg/ml。mtDNA 與腹膜溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)率(r =0.461,P0.001)、IL-6(r = 0.568,P0.001)、TNF-α(r = 0.454,P0.001)和 IFN-γ(r = 0.203,P= 0.005)均呈正相關(guān)。廣義線性回歸模型中,mtDNA是IL-6的獨(dú)立相關(guān)因素。女性、使用2.5%葡萄糖透析液、透析劑量、mtDNA和IL-6是PSTR的獨(dú)立相關(guān)因素(P0.05)。不同mtDNA水平患者生存率無(wú)明顯差異,多因素Cox回歸結(jié)果顯示透出液mtDNA不是患者死亡及技術(shù)失敗的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P0.05)。結(jié)論透出液mtDNA與腹腔局部炎癥程度相關(guān),并且是PSTR的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素,但不是患者死亡和技術(shù)失敗的危險(xiǎn)因素。第二部分透出液線粒體DNA含量與腹膜炎預(yù)后的關(guān)系研究目的腹膜透析相關(guān)性腹膜炎是腹膜透析(Peritoneal dialysis,PD)患者最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一。盡管近年來(lái)腹膜炎發(fā)生率有所下降,但其仍是導(dǎo)致PD患者死亡或技術(shù)失敗的重要原因。線粒體DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)能夠激活免疫系統(tǒng)引起免疫放大反應(yīng)。研究表明,循環(huán)中mtDNA水平與創(chuàng)傷或膿毒血癥預(yù)后相關(guān),但其在腹膜透析相關(guān)性腹膜炎中的作用尚不清楚。本研究旨在探討腹膜透出液中mtDNA含量與腹膜透析相關(guān)性腹膜炎預(yù)后的關(guān)系。方法前瞻性選取2014年6月1日～2015年9月30日發(fā)生腹膜透析相關(guān)性腹膜炎并在我院就診的維持性腹膜透析患者。所有患者在腹膜炎第1天和第3天留取透出液標(biāo)本,熒光定量PCR法檢測(cè)透出液中mtDNA、細(xì)菌DNA(BacteriaDNA,bDNA)含量,ELISA法檢測(cè)IL-6水平。記錄患者基本信息、實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)及腹膜炎治療結(jié)局等資料。隨訪期限為腹膜炎治療后1個(gè)月,將患者分為治愈組和退出組,應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果研究期間共發(fā)生237例腹膜炎,符合研究納入標(biāo)準(zhǔn)的共有94例,其中男性60例,女性34例,平均年齡為54.2 ± 12.7歲,平均Charslon合并癥指數(shù)評(píng)分為3.4 士1.5,中位透析齡24.9個(gè)月。第1天和第3天退出組透出液中mtDNA均顯著高于治愈組(P= 0.004和P0.001);第1天兩組bDNA比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P =0.093),但第3天退出組bDNA顯著高于治愈組(P0.001)。Pearson相關(guān)分析顯示第3天透出液mtDNA、bDNA、IL-6、透出液白細(xì)胞及hs-CRP均呈正相關(guān)(P0.05),且相關(guān)性相比于第1天均有所提高。第1天和第3天mtDNA的AUC分別為0.772和 0.894,bDNA 的 AUC 為 0.657 和 0.827,白細(xì)胞的 AUC 為 0.472 和 0.788。根據(jù)第3天ROC曲線和約登指數(shù)最大原則,mtDNA截?cái)嘀导s為163000 copies/ul(約登指數(shù)0.687,靈敏度72.7%,特異度95.9%),bDNA截?cái)嘀导s為1700 copies/ul(約登指數(shù)0.710,靈敏度81.8%,特異度89.2%),白細(xì)胞截?cái)嘀导s為1220個(gè)/ul(約登指數(shù)0.596,靈敏度63.6%,特異度96.9%)。根據(jù)3個(gè)指標(biāo)的截?cái)嘀祵⒆兞恐匦路譃楦叩蛢山M。多元logistic回歸分析結(jié)果顯示mtDNA(OR = 29.363,P=0.01)和bDNA(OR= 12.151,P = 0.037)為腹膜炎治療失敗的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。依據(jù)mtDNA和bDNA建立風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型,綜合風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分(Summary Risk Score,SRS)模型公式=3.38*mtDNA(0 或 1)+ 2.497*bDNA(0 或 1)。模型 ROC 曲線下面積為 0.887(95%CI 0.742-1.000,P0.001)其預(yù)測(cè)腹膜炎治療失敗的靈敏度為72.7%,特異度為100%。結(jié)論腹膜炎患者透出液中mtDNA水平與炎癥程度相關(guān),并且是腹膜炎治療失敗的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。利用第3天透出液mtDNA和bDNA水平預(yù)測(cè)腹膜炎預(yù)后有良好的準(zhǔn)確度,可作為預(yù)測(cè)腹膜炎預(yù)后的新的標(biāo)志物,需要大樣本研究進(jìn)一步證實(shí)。第三部分線粒體DNA誘導(dǎo)小鼠急性腹膜炎癥及其作用機(jī)制初步研究目的:腹膜透析(Peritoneal dialysis,PD)患者長(zhǎng)期處于炎癥狀態(tài),反復(fù)發(fā)生和持續(xù)存在的炎癥已被證實(shí)與腹膜透析的不良預(yù)后相關(guān)。線粒體DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)同細(xì)菌DNA(Bacterial DNA,bDNA)一樣,含有大量未甲基化的CpG序列,能夠激活TLR9(Toll-like receptor 9),引起炎癥反應(yīng),造成組織器官損傷。另外,mtDNA還可能通過(guò)激活NLRP3炎癥體(inflammasome),從而促進(jìn)IL-1β的表達(dá)和分泌,介導(dǎo)炎癥產(chǎn)生。作者研究中發(fā)現(xiàn),無(wú)論在慢性PD患者還是發(fā)生急性腹膜炎的患者透出液中均檢測(cè)到mtDNA水平升高,并與炎癥程度呈正相關(guān),同時(shí)影響腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能和腹膜炎預(yù)后。為此,我們將通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討mtDNA在腹膜炎癥發(fā)生發(fā)展中的作用及其可能機(jī)制:(1)利用LPS造小鼠急性腹膜炎模型,驗(yàn)證mtDNA在腹膜炎的作用;(2)探討mtDNA是否通過(guò)激活TLR9和NLRP3通路介導(dǎo)腹膜炎癥反應(yīng)和損傷。方法:選取C57BL/6健康雄性小鼠,分為7組:生理鹽水組(對(duì)照組),低LPS組(2mg/kg),高 LPS組(10mg/kg),低mtDNA組(0.2mg/kg),高 mtDNA組(1mg/kg),低bDNA組(0.2mg/kg),高bDNA組(1mg/kg)。腹腔注射各組干預(yù)藥物,在注射后6h和24h處死小鼠,處死前每只小鼠腹腔注射2ml生理鹽水,處死后吸取腹腔灌洗液,進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)、PCR法檢測(cè)mtDNA水平、ELISA檢測(cè)IL-1β和IL-6含量;切取小鼠腹壁組織、網(wǎng)膜和腸系膜組織,HE和Masson染色觀察腹膜組織形態(tài)學(xué)改變、MitoSOX熒光檢測(cè)間皮細(xì)胞內(nèi)線粒體功能改變、電鏡觀察間皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變。RT-PCR法檢測(cè)腹膜組織內(nèi)TLR9和NLRP3mRNA表達(dá)水平。用SPSS 19.0和GraphPad 6.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果:注射不同劑量LPS后,在6小時(shí)腹腔灌洗液中mtDNA水平顯著升高,并且注射LPS劑量越大,mtDNA水平越高。在24小時(shí),mtDNA水平較第6小時(shí)均有所下降,但高劑量LPS組mtDNA水平仍顯著高于對(duì)照組和低劑量LPS組。并且mtDNA水平與炎癥程度顯著相關(guān),mtDNA濃度越高,IL-1β、IL-6水平和白細(xì)胞數(shù)量也越高。同時(shí),注射mtDNA或bDNA6小時(shí)后,各組腹膜組織TLR9和NLRP3 mRNA表達(dá)量上調(diào),各組腹腔灌洗液中白細(xì)胞數(shù)量、IL-1β和IL-6水平均顯著高于對(duì)照組(P0.05),并且這種bDNA或mtDNA劑量呈正相關(guān)性。在24小時(shí),腹膜組織TLR9和NLRP3 mRNA表達(dá)量較對(duì)照組有所下降,各組白細(xì)胞數(shù)量、IL-1 β和IL-6水平較第6小時(shí)下降,但仍顯著高于對(duì)照組(P0.05);腹膜組織病理改變可見(jiàn)腹膜組織水腫增厚,大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、腹膜間皮細(xì)胞下膠原纖維增多;電鏡下可見(jiàn)間皮細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變、間皮細(xì)胞脫落、細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張改變。結(jié)論:動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了急性腹膜炎時(shí)可引起腹腔內(nèi)mtDNA水平升高,mtDNA可能通過(guò)激活TLR9和NLRP3受體激活免疫反應(yīng)信號(hào)通路,引起炎癥反應(yīng),引起腹膜組織形態(tài)、病理改變及功能障礙。
【關(guān)鍵詞】：腹膜透析 線粒體DNA 炎癥 腹膜溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)率 預(yù)后 腹膜透析相關(guān)性腹膜炎 細(xì)菌DNA 炎癥 預(yù)后 腹膜炎 線粒體DNA Toll-likereceptor9 NLRP3炎癥體
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R572.2;R459.5
【目錄】：

• 致謝5-6
• 中文摘要6-12
• 英文摘要12-18
• 縮略對(duì)照詞表18-23
• 第一部分 透出液線粒體DNA含量與腹腔炎癥狀態(tài)及腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能的關(guān)系研究23-64
• 前言23-25
• 1 對(duì)象和方法25-40
• 1.1 研究對(duì)象25
• 1.2 臨床資料收集25-28
• 1.3 透出液標(biāo)本留取和保存28
• 1.4 主要試劑和耗材28-30
• 1.5 線粒體Cytochrome B基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)準(zhǔn)曲線制備30-35
• 1.6 腹膜透出液線粒體DNA提取與檢測(cè)35-37
• 1.7 ELISA實(shí)驗(yàn)37-38
• 1.8 統(tǒng)計(jì)方法38-40
• 2 結(jié)果40-56
• 2.1 基本資料40-42
• 2.2 mtDNA和炎癥因子含量及相關(guān)性42-45
• 2.3 PSTR與mtDNA、炎癥因子相關(guān)性45-46
• 2.4 mtDNA、IL-6與PSTR的預(yù)測(cè)因素46-49
• 2.5 mtDNA預(yù)測(cè)腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)特性效能49-50
• 2.6 生存分析50-56
• 3 討論56-59
• 4 結(jié)論59-60
• 參考文獻(xiàn)60-64
• 第二部分 透出液線粒體DNA含量與腹膜炎預(yù)后的關(guān)系研究64-99
• 前言64-66
• 1 對(duì)象和方法66-81
• 1.1 研究對(duì)象66
• 1.2 臨床資料66-67
• 1.3 透出液標(biāo)本留取和保存67
• 1.4 主要試劑和耗材67-69
• 1.5 線粒體CYTOCHROME B基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)準(zhǔn)曲線制備69-74
• 1.6 細(xì)菌16S DNA基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)準(zhǔn)曲線制備74-75
• 1.7 透出液線粒體DNA提取75-76
• 1.8 透出液細(xì)菌DNA提取76
• 1.9 腹膜透出液中游離線粒體DNA和細(xì)菌DNA含量檢測(cè)76-78
• 1.10 ELISA實(shí)驗(yàn)78-80
• 1.11 統(tǒng)計(jì)方法80-81
• 2 結(jié)果81-92
• 2.1 基本信息及培養(yǎng)結(jié)果81-83
• 2.2 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)83-86
• 2.3 不同培養(yǎng)結(jié)果間mtDNA、bDNA比較86
• 2.4 mtDNA、bDNA、IL-6、白細(xì)胞及hs-CRP相關(guān)性86-88
• 2.5 mtDNA、bDNA及白細(xì)胞ROC曲線比較88
• 2.6 腹膜炎預(yù)后危險(xiǎn)因素分析88-90
• 2.7 腹膜炎預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型90-92
• 3 討論92-95
• 4 結(jié)論95-96
• 參考文獻(xiàn)96-99
• 第三部分 線粒體DNA誘導(dǎo)小鼠急性腹膜炎癥及其作用機(jī)制初步研究99-126
• 前言99-100
• 1 實(shí)驗(yàn)方法和材料100-109
• 1.1 研究對(duì)象100
• 1.2 主要試劑100-101
• 1.3 主要儀器設(shè)備和耗材101-103
• 1.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法103-108
• 1.5 統(tǒng)計(jì)分析108-109
• 2 結(jié)果109-120
• 2.1 LPS組腹腔灌洗液游離mtDNA含量109-110
• 2.2 LPS組腹腔灌洗液IL-1β和IL-6水平110-111
• 2.3 LPS組腹腔灌洗液白細(xì)胞數(shù)量111-112
• 2.4 LPS組腹腔灌洗液mtDNA、炎癥因子和白細(xì)胞數(shù)量相關(guān)性112-113
• 2.5 bDNA和mtDNA組腹腔灌洗液IL-1β和IL-6水平113-114
• 2.6 bDNA和mtDNA組腹腔灌洗液白細(xì)胞數(shù)量114-115
• 2.7 bDNA和mtDNA組腹膜組織TLR9和NLRP3 mRNA表達(dá)115-116
• 2.8 各組腹膜組織HE和Masson染色病理表現(xiàn)116-118
• 2.9 各組腹膜組織線粒體氧化應(yīng)激表現(xiàn)118
• 2.10 各組腹膜組織電鏡病理表現(xiàn)118-120
• 3 討論120-122
• 4 結(jié)論122-123
• 參考文獻(xiàn)123-126
• 結(jié)語(yǔ)與展望126-127
• 綜述127-140
• 參考文獻(xiàn)135-140
• 作者簡(jiǎn)介140

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1 封維陽(yáng),顧美芳,李秀凱;腹膜透出液真菌培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本106份分析[J];臨床皮膚科雜志;1999年03期

2 胡海云,賈妝漢,王學(xué)玉,姜詩(shī)琴;透橋患者的氨基酸分析[J];臨床內(nèi)科雜志;1990年04期

3 劉加林,吳玉坤,胡吉臬,趙京;隔夜腹膜透出液與血清成份的比較研究[J];貴州醫(yī)藥;1996年05期

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本文編號(hào)：555614