發(fā)布時(shí)間：2017-06-29 07:29

  本文關(guān)鍵詞：醛固酮經(jīng)非基因組途徑激活氧化應(yīng)激通路調(diào)控大鼠肝星狀細(xì)胞收縮遷移的機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景 慢性肝病是威脅人類(lèi)健康并耗費(fèi)大量衛(wèi)生資源的“全球公共健康問(wèn)題”。我國(guó)是肝病大國(guó),病毒性肝炎的發(fā)病和流行情況十分嚴(yán)重。隨著人民生活水平的日益提高,由脂肪性肝病所導(dǎo)致的肝纖維化以及進(jìn)一步發(fā)展而形成的肝硬化,同樣對(duì)國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人民健康造成嚴(yán)重威脅。因此,積極探索肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)機(jī)制,不僅是預(yù)防和治療肝纖維化的重要課題,對(duì)保護(hù)我國(guó)有限的醫(yī)療資源、維持社會(huì)經(jīng)坊良好發(fā)展也具有重要意義。 肝纖維化是由各種致病因子所引起的肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生,導(dǎo)致肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)(fibrillar extracellular matrix, ECM)過(guò)度沉積的病理過(guò)程,是多種肝臟慢性疾病向肝硬化、門(mén)脈高壓甚至肝癌等進(jìn)一步發(fā)展惡化的重要中間環(huán)節(jié)。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell, HSC)的活化被認(rèn)為是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié),多種致纖維化因素均以HSC作為最終靶細(xì)胞,通過(guò)活化靜止?fàn)顟B(tài)下的HSC而誘導(dǎo)肝纖維化發(fā)生并促進(jìn)其發(fā)展�；罨蟮腍SC大量增殖并遷移至肝竇血管入口處,收縮加強(qiáng),致使肝竇直徑縮小、阻力增大,一方面通過(guò)擠壓肝竇以增加肝內(nèi)血管阻力,另一方面造成肝組織瘢痕攣縮而進(jìn)一步增加肝內(nèi)血管阻力。目前,肝內(nèi)血管阻力增加被認(rèn)為是引起門(mén)脈高壓的重要因素,肝內(nèi)微循環(huán)障礙是導(dǎo)致門(mén)脈高壓的重要因素之一。有研究指出,門(mén)脈高壓治療的關(guān)鍵在于控制肝竇內(nèi)皮功能失調(diào)和抑制血管生成。因此,抑制HSC的過(guò)度活化及降低門(mén)靜脈壓力就成為防治肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。 研究證實(shí),腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)同樣存在于局部組織,如肝臟中,且與器官纖維化的發(fā)生密切相關(guān)。在肝內(nèi),RAAS可能參與門(mén)脈高壓的調(diào)控。研究表明醛固酮(Aldo)具有促進(jìn)HSC收縮的作用,但醛固酮對(duì)HSC收縮與遷移的調(diào)控機(jī)制,以及醛固酮受體拮抗劑螺內(nèi)酯是否能夠通過(guò)抑制HSC收縮來(lái)降低肝內(nèi)阻力、緩解門(mén)脈高壓,目前鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。因此,本課題致力于研究Aldo對(duì)HSC收縮與遷移的調(diào)控機(jī)制,并探索醛固酮受體拮抗劑螺內(nèi)酯在緩解肝纖維化及治療門(mén)脈高壓時(shí)的作用機(jī)理。 HSC的收縮可由鈣依賴(lài)途徑和非鈣依賴(lài)途徑兩種方式產(chǎn)生,近年研究認(rèn)為,非鈣依賴(lài)途徑在HSC的收縮過(guò)程中起主要作用。而在非鈣依賴(lài)途徑中,RhoA-ROCK通路對(duì)HSC收縮的調(diào)控則可能起著主導(dǎo)作用。Rho族蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白和細(xì)胞骨架重組而調(diào)節(jié)細(xì)胞的收縮和遷移,同時(shí),激活的RhoA和ROCK既可通過(guò)抑制內(nèi)皮來(lái)源的N0生成而促進(jìn)細(xì)胞和血管收縮,又可通過(guò)降低eNOS表達(dá)直接促進(jìn)細(xì)胞收縮和縮血管效應(yīng),從而誘導(dǎo)門(mén)脈高壓的形成。 近年來(lái),Aldo的非基因組調(diào)控受到研究人員重視。與基因組調(diào)控方式不同,在非基因組調(diào)控方式中,激活的鹽皮質(zhì)激素受體(MR)不發(fā)生核轉(zhuǎn)位,因而不參與靶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。非基因組效應(yīng)具有快捷、高效的特點(diǎn),對(duì)于研究細(xì)胞收縮、遷移、內(nèi)皮功能紊亂、血管生成等功能的變化有重要意義。在眾多非基因組調(diào)控方式中,小窩蛋白-1(Caveolin-1, Cav-1)介導(dǎo)的非基因組效應(yīng)是最為重要的一類(lèi)。 小窩是由外胞漿膜內(nèi)陷而形成的細(xì)頸瓶狀結(jié)構(gòu),其內(nèi)富含膽固醇和神經(jīng)鞘脂,可作為錨定信號(hào)分子的暫時(shí)性平臺(tái),與胞膜運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、鈣通道、脂質(zhì)再循環(huán)等眾多細(xì)胞事件有關(guān)。Caveolin蛋白是構(gòu)成小窩的主要結(jié)構(gòu)蛋白,以Cav-1分布最為廣泛、功能最為全面,研究也最為深入。Cav-1蛋白可作為信號(hào)分子的支架,將MR、Src、PDGFR、Rho GTPase等信號(hào)分子區(qū)室化于小窩之中,這些分子及相關(guān)下游通路物質(zhì)可轉(zhuǎn)位至小窩內(nèi),通過(guò)相互對(duì)話(huà)(crosstalk)以產(chǎn)生快速調(diào)控效應(yīng)。在小窩介導(dǎo)的信號(hào)通路中,Src激酶是Cav-1非基因組調(diào)節(jié)通路的關(guān)鍵中介,它可進(jìn)一步調(diào)控下游通路中的PI3K/Akt、NADPH氧化酶、Rho-GTPase等。值得注意的是,Src可促進(jìn)Cav-1的Tyr14位點(diǎn)磷酸化,一方面引起因與cav-1結(jié)合而被抑制的eNOS釋放,促進(jìn)NO的生成；另一方面激活Rho-GTPase而促進(jìn)細(xì)胞收縮和遷移。由于MR等多種相關(guān)受體被激活后可向小窩內(nèi)轉(zhuǎn)位,因此Aldo的非基因組作用如遷移、炎癥反應(yīng)、NO合成、血管生成、氧化應(yīng)激多與小窩有關(guān)。 近年來(lái),氧化應(yīng)激反應(yīng)在器官纖維化病變中的作用機(jī)制受到越來(lái)越多的研究人員的關(guān)注。氧化應(yīng)激是機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)過(guò)度產(chǎn)生、內(nèi)源性抗氧化防御功能減弱所致的氧化/抗氧化平衡失調(diào)而引起的組織或細(xì)胞損傷過(guò)程。ROS主要產(chǎn)生于線(xiàn)粒體及微粒體氧化還原反應(yīng)的電子傳遞過(guò)程中,此外,還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)氧化酶、NO合酶以及環(huán)氧合酶等催化的反應(yīng)過(guò)程中,均可伴ROS生成。大量文獻(xiàn)證實(shí),氧化應(yīng)激反應(yīng)在器官纖維化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中扮演關(guān)鍵角色,各種引起肝纖維化病變的致病因素幾乎均利用氧化應(yīng)激通路參與肝纖維化病變的調(diào)控。肝內(nèi)過(guò)量ROS不僅可直接誘導(dǎo)HSC活化、增殖,促進(jìn)HSC遷移、收縮并合成和分泌大量胞外基質(zhì),尚可刺激肝細(xì)胞、庫(kù)否細(xì)胞等生成大量炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子,如血小板衍化生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor, PDGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(Transforming growth factor beta, TGF-p)等,間接誘導(dǎo)HSC的活化與增殖。由此可見(jiàn),氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)于肝纖維化的發(fā)生發(fā)展亦起到關(guān)鍵作用。 醛固酮在腎小球系膜細(xì)胞、輸尿管上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞中具有誘導(dǎo)ROS生成的作用已見(jiàn)諸報(bào)道,局部RAAS在誘導(dǎo)組織器官氧化應(yīng)激水平升高,進(jìn)而促進(jìn)組織、器官的纖維化改變等方面亦有研究證實(shí)。如前所述,在肝臟纖維化病變過(guò)程中,局部RAAS同樣表現(xiàn)活躍,HSC自身醛固酮的合成與分泌均有明顯升高,因此,探索醛固酮誘導(dǎo)大鼠HSC收縮遷移的機(jī)制以及其在肝纖維化形成過(guò)程中對(duì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激途徑的調(diào)控機(jī)制就成為本課題的研究重點(diǎn)。由于小窩可區(qū)室化鹽皮質(zhì)激素受體(MR)以及NADPH氧化酶等,我們推測(cè)小窩與醛固酮刺激后HSC內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)等活動(dòng)均密切相關(guān),醛固酮可能通過(guò)小窩所介導(dǎo)的非基因組依賴(lài)的調(diào)控方式誘導(dǎo)HSC中ROS的過(guò)量生成,進(jìn)而通過(guò)RhoA/Rock通路實(shí)現(xiàn)HSC的活化并誘導(dǎo)HSC發(fā)生增殖、收縮、遷移等一系列細(xì)胞特性和生理功能的改變。 研究目的 本課題擬研究醛固酮經(jīng)小窩所介導(dǎo)的非基因組通路,調(diào)控HSC內(nèi)氧化應(yīng)激水平,激活RhoA/Rock等相關(guān)信號(hào)通路的機(jī)制,深入探討醛固酮經(jīng)cav-1相關(guān)的非基因組通路調(diào)控HSC活化、收縮、遷移的機(jī)制,為闡明醛固酮在門(mén)脈高壓形成過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制提供新線(xiàn)索,為探尋門(mén)脈高壓及肝纖維化的防治靶點(diǎn)提供新的思路。 研究方法 1、分離培養(yǎng)原代大鼠肝星狀細(xì)胞：原位灌注結(jié)合離體灌注、密度梯度離心結(jié)合差速貼壁法分離并培養(yǎng)原代大鼠肝星狀細(xì)胞,以肝星狀細(xì)胞標(biāo)記蛋白a-SMA免疫熒光染色鑒定細(xì)胞純度,選擇體外培養(yǎng)第2-5代大鼠肝星狀細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)體外細(xì)胞試驗(yàn)。 2、小窩蛋白提取實(shí)驗(yàn)：以10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)原代大鼠肝星狀細(xì)胞,待培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí),進(jìn)行12小時(shí)饑餓處理,并給予相關(guān)藥物干預(yù),處理完成后裂解細(xì)胞并勻漿,蔗糖密度梯度離心分離蛋白并以冷丙酮沉淀純化,蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)目的蛋白含量變化。 3、膽固醇耗竭與重裝填實(shí)驗(yàn)：向貼壁生長(zhǎng)且狀態(tài)良好的原代大鼠肝星狀細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入終濃度為5nM的MCD溶液,于37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育30min后,以溫PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞,即可去除細(xì)胞內(nèi)膽固醇；以5m1濃度為50nM的MCD溶液溶解lmg膽固醇,取該溶液加入膽固醇耗竭處理后的細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi),使MCD終濃度為5nM,細(xì)胞置于37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育30min,即完成膽固醇重裝過(guò)程。 4、Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：將制備好的原代大鼠肝星狀細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)后加入Transwell上室內(nèi),于上、下室中分別加入無(wú)血清培基和含20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基,施加相應(yīng)藥物干預(yù)后將細(xì)胞置于孵箱內(nèi)培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間,孵育完成后,棄培基,以PBS清洗細(xì)胞并以甲醇固定細(xì)胞,隨后進(jìn)行結(jié)晶紫染色并于顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)目。 5、凝膠收縮實(shí)驗(yàn)：將原代大鼠肝星狀細(xì)胞接種于事先制備好的膠原晶格中,待細(xì)胞貼壁后分離膠原晶格與培養(yǎng)板底部,施加相應(yīng)刺激并孵育適當(dāng)時(shí)間后,拍照并計(jì)算剩余膠原晶格面積,分析膠原晶格收縮情況。 6、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)：以10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)原代大鼠肝星狀細(xì)胞,待培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí),進(jìn)行12小時(shí)饑餓處理,并給予相關(guān)藥物干預(yù),處理完成后裂解細(xì)胞并勻漿,依次進(jìn)行誘餌抗體孵育、瓊脂糖連接蛋白A/G孵育、離心沉淀、蛋白高溫變性等處理,獲得目的蛋白后,行蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)分析目的蛋白含量改變情況。 7、免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)：制備原代大鼠肝星狀細(xì)胞爬片并完成相關(guān)干預(yù)后,以4%多聚甲醛固定細(xì)胞,封閉非特異性抗原,依次孵育第一抗體及第二抗體并染核封片,于熒光顯微鏡／共聚焦顯微鏡下觀察并分析。 8、動(dòng)物模型建立：4周齡雄性SD大鼠36只,體重為120-150g,隨機(jī)等分為6組,分別行手術(shù)處理,術(shù)后24h內(nèi)禁食禁水,自術(shù)后第3天起按照分組給予相應(yīng)藥物治療或不做特殊處理,給藥6周后宰殺全部大鼠,分別留取血清、肝臟組織,制作肝臟組織石蠟標(biāo)本及冰凍標(biāo)本并進(jìn)行進(jìn)一步研究分析。 9、免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)：制備組織石蠟切片標(biāo)本,常規(guī)脫蠟、水化后進(jìn)行高溫抗原修復(fù),隨后依次滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、封閉非特異性抗原、孵育第一抗體和第二抗體以及DAB顯色,顯色完成后以蘇木素染核并行脫水、透明、封片處理,即可于顯微鏡下觀察、拍照并分析結(jié)果。 10、蛋白電泳及免疫印跡實(shí)驗(yàn)：制備細(xì)胞或組織勻漿,完成離心、濃度測(cè)定及高溫變性等步驟后,將混有上樣緩沖液的總蛋白提取液加入事先制備好的丙烯酰胺凝膠電泳槽中進(jìn)行蛋白電泳,目的蛋白分離后,進(jìn)一步進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、非特異性抗原封閉以及抗體孵育,完成后以遠(yuǎn)紅外成像儀檢測(cè)目的蛋白熒光值并進(jìn)行半定量分析。 研究結(jié)果 1、10-7M的Aldo對(duì)原代大鼠肝星狀細(xì)胞內(nèi)小窩蛋白cav-1和蛋白酪氨酸激酶c-src的磷酸化激活效應(yīng)顯著升高；原代大鼠肝星狀細(xì)胞在該濃度Aldo刺激30min時(shí),其cav-1蛋白和c-src蛋白的磷酸化激活達(dá)到峰值。 2、凝膠收縮試驗(yàn)示：Aldo刺激組的凝膠晶格面積明顯減小,加入抑制劑干預(yù)后,凝膠晶格收縮受到抑制；細(xì)胞遷移試驗(yàn)中,Aldo刺激可以顯著增加遷移至小室下表面的細(xì)胞數(shù),應(yīng)用抑制劑干預(yù)后,細(xì)胞遷移數(shù)目較Aldo刺激組明顯減少。 3、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)提示：Aldo刺激原代大鼠肝星狀細(xì)胞30min時(shí),細(xì)胞內(nèi)MR蛋白與c-src蛋白間相互作用明顯增強(qiáng),而Aldo刺激并并不改變cav-1蛋白與MR蛋白間相互作用關(guān)系。 4、膽固醇耗竭與重裝填實(shí)驗(yàn)示：當(dāng)耗竭原代大鼠肝星狀細(xì)胞內(nèi)膽固醇,即破壞小窩完整結(jié)構(gòu)后,Aldo對(duì)cav-1和c-src的磷酸化激活作用受到明顯抑制；而當(dāng)膽固醇重裝填,即恢復(fù)細(xì)胞膜小窩結(jié)構(gòu)完整性后,Aldo對(duì)cav-1和c-src蛋白的磷酸化激活能力得以恢復(fù)。 5、細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)及過(guò)氧化氫(H202)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)顯示：Aldo可顯著促進(jìn)原代大鼠肝星狀細(xì)胞內(nèi)ROS及H202的生成,當(dāng)應(yīng)用相應(yīng)抑制劑干預(yù)后,Aldo的促ROS及H202生成的作用被抑制。 6、蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)及GST-Pull Down實(shí)驗(yàn)示：Aldo刺激可顯著增加原代大鼠肝星狀細(xì)胞內(nèi)NOX4蛋白表達(dá)和RhoA蛋白的激活,并進(jìn)一步促進(jìn)下游通路中moesin蛋白、mlc蛋白的磷酸化激活和a-SMA蛋白及膠原蛋白的合成；當(dāng)應(yīng)用抑制劑阻斷后,相應(yīng)通路下游蛋白對(duì)Aldo刺激的應(yīng)答反應(yīng)明顯減弱。 7、體內(nèi)試驗(yàn)對(duì)大鼠肝纖維化及藥物治療模型評(píng)估示：BDL組大鼠血清Aldo含量顯著升高,肝組織內(nèi)H202及羥脯氨酸含量明顯增多,肝纖維化病變嚴(yán)重；各治療組大鼠血清Aldo、肝組織內(nèi)H202及羥脯氨酸含量均較對(duì)照組升高,但明顯低于BDL組,肝纖維化病變程度介于對(duì)照組與BDL組之間。 8、肝組織免疫熒光雙染示：BDL組大鼠肝內(nèi)代表cav-1蛋白與a-SMA蛋白的熒光亮度顯著增強(qiáng),且共染定位趨向分布于肝竇、匯管區(qū)及小血管周?chē)?各藥物治療組大鼠肝組織內(nèi)共染熒光范圍及亮度較BDL組明顯減少。 9、肝組織免疫組化雙染示：BDL組大鼠肝內(nèi)NOX4蛋白與a-SMA蛋白表達(dá)顯著增多,且共染色細(xì)胞趨向分布于肝竇部、匯管區(qū)等處,各藥物治療組大鼠肝組織內(nèi)共染細(xì)胞數(shù)目較BDL組明顯減少。 10、肝組織總蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)及GST-Pull Down實(shí)驗(yàn)示：BDL組大鼠肝內(nèi)cav-1蛋白、NOX4蛋白、a-SMA蛋白及collagen蛋白表達(dá)明顯升高,RhoA的活化、moesin蛋白及mlc蛋白的磷酸化均明顯增強(qiáng),各治療組大鼠肝內(nèi),上述蛋白表達(dá)或磷酸化水平受到不同程度抑制。 研究結(jié)論 1、Aldo可通過(guò)上調(diào)原代大鼠HSC內(nèi)氧化應(yīng)激水平,增加細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生而活化HSC,促進(jìn)其收縮和遷移。 2、Aldo可通過(guò)小窩所介導(dǎo)的非基組調(diào)節(jié)途徑上調(diào)原代大鼠HSC內(nèi)氧化應(yīng)激水平,并進(jìn)一步激活HSC,促進(jìn)其收縮和遷移。 3、膽管結(jié)扎可誘導(dǎo)大鼠血清Aldo含量、肝內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高以及肝纖維化的發(fā)生,這種作用可被Aldo受體拮抗劑或抗氧化劑所抑制。4、在膽管結(jié)扎誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型中,Aldo促進(jìn)小窩蛋白cav-1及氧 化應(yīng)激相關(guān)蛋白NOX4(NADPH氧化酶組分)在HSC中的表達(dá),并可活化HSC,使 其向肝竇血管、匯管區(qū)等處遷移和收縮。5、結(jié)合已有文獻(xiàn)報(bào)道及本課題研究結(jié)果,我們推斷在醛固酮經(jīng)非基因組途 徑激活氧化應(yīng)激通路,調(diào)控大鼠肝星狀細(xì)胞收縮和遷移的過(guò)程中,可能存在如 下信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：醛固酮↑→MR→c-src→cav-1→NADPH氧化酶細(xì)胞變性壞死RhoA GTPase炎癥因子釋放氧化應(yīng)激增強(qiáng)Rock↓肝硬化圖1：課題相關(guān)信號(hào)通路Fig1：Topics related signaling pathways
【關(guān)鍵詞】：醛固酮 小窩蛋白 氧化應(yīng)激 肝纖維化 非基因組調(diào)控
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R575
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-22
• 前言22-28
• 材料與方法28-66
• 1、主要試劑、材料與設(shè)備28-31
• 2、實(shí)驗(yàn)方法31-66
• 結(jié)果66-114
• 討論114-120
• 結(jié)論120-121
• 參考文獻(xiàn)121-127
• 成果127-128
• 致謝128-130
• 附錄：英文縮略語(yǔ)對(duì)照表130-131

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

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  本文關(guān)鍵詞：醛固酮經(jīng)非基因組途徑激活氧化應(yīng)激通路調(diào)控大鼠肝星狀細(xì)胞收縮遷移的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：497029