本文關(guān)鍵詞：黏蛋白Core 2 O-型糖鏈的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景＆目的 腸黏液屏障作為機(jī)體抵御外界損害的天然屏障，其粘液主要由黏蛋白組成，而黏蛋白中絕大部分分子質(zhì)量是由O-型糖鏈(少量N-型糖鏈)組成，因此黏蛋白中的O-型糖鏈與其功能密切相關(guān)，有研究表明，某些O-型糖鏈?zhǔn)亲鳛橐恍┘?xì)菌表面的黏附素連接碳水化合物的配體；黏蛋白O-型糖基化的改變將伴隨腫瘤的發(fā)生和調(diào)節(jié)腫瘤的生長、粘附、侵襲、轉(zhuǎn)移，然而黏蛋白O-型糖鏈在調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)行為方面和腸道致病菌與腸上皮細(xì)胞相互作用機(jī)制方面尚不清楚。 O-型糖鏈根據(jù)不同連接在絲氨酸、蘇氨酸和脯氨酸分子上的單糖分子及其糖化模式的不同可以主要區(qū)分為Core1，Core2，Core3和Core4四種不同的O-型糖鏈，而Core2O-型糖鏈主要表達(dá)于胃和結(jié)腸，因此我們通過benzyl-α-GalNAc抑制O-型糖鏈的合成來探討其參與大腸桿菌（EPEC和EHEC O157:H7）對腸上皮細(xì)胞侵襲的影響；對Core2O-型糖鏈合成酶（C2GnT-2）用RNA干擾技術(shù)抑制其表達(dá)，進(jìn)而探討其參與大腸桿菌（EPEC和EHEC O157:H7）對腸上皮細(xì)胞侵襲的分子機(jī)制和生物學(xué)行為改變的影響，從而揭示黏蛋白O-型糖基化及其Core2型糖鏈參與大腸桿菌（EPEC和EHEC O157:H7）對腸上皮細(xì)胞侵襲的影響，以及對腸上皮細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。 方法 1. HT-29細(xì)胞培養(yǎng)及促分化細(xì)胞（HT-29-Gal）模型的建立。 2. O-型糖鏈抑制劑（benzyl-N-acetyl-α-D-galactosaminide，benzyl-α-GalNAc）處理HT-29細(xì)胞和HT-29-Gal細(xì)胞,獲得HT-29-Obn細(xì)胞和HT-29-Gal-Obn細(xì)胞。 3.細(xì)胞免疫熒光檢測HT-29、HT-29-Gal、HT-29-Obn和HT-29-Gal-obn細(xì)胞中凝集素的變化。 4. HT-29、HT-29-Gal、HT-29-Obn和HT-29-Gal-obn細(xì)胞分別與EPEC和EHECO157:H7共孵育2h，PBS清洗去除未粘附的細(xì)菌，再加入慶大霉素（100ug/ml）培養(yǎng)2h，殺滅粘附于細(xì)胞表面的細(xì)菌，再加入0.25%胰酶和0.025%Triton X100裂解細(xì)胞，釋放出細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌，最后采用系列稀釋裂解液瓊脂板克隆計(jì)數(shù)觀察侵襲入細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)目。 5. qRT-PCR和Western blotting檢測HT-29、shRNA-Ctr/HT-29和shRNA-C2GnT-2/HT-29細(xì)胞中C2GnT-2干擾效率。 6．電阻測定儀檢測shRNA-Ctr/HT-29細(xì)胞和shRNA-C2GnT-2/HT-29細(xì)胞在EPEC或EHEC O157:H7感染或未感染下電阻的變化情況及免疫熒光染色緊密鏈接蛋白（ZO-1和Occludin）的變化情況。 7. ELISA檢測shRNA-Ctr/HT-29細(xì)胞和shRNA-C2GnT-2/HT-29細(xì)胞在EPEC或EHEC O157:H7感染或未感染下IL-6或IL-8的變化情況。 8.免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測HT-29、shRNA-Ctr/HT-29和shRNA-C2GnT-2/HT-29細(xì)胞凝集素的變化情況。 9．MTT實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測C2GnT-2干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞后，細(xì)胞生物學(xué)行為的改變。 10. Western blotting檢測C2GnT-2干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞后，細(xì)胞鏈接蛋白ZO-1、Occludin、E-cadherin和凋亡蛋白Caspase-3的變化情況。 結(jié)果 1.凝集素組織化學(xué)染色HT-29、HT-29-Gal、HT-29-Obn和HT-29-Gal-obn細(xì)胞中凝集素顯示，7種凝集素在HT-29-Obn和HT-29兩種細(xì)胞中的表達(dá)量和形態(tài)學(xué)上的變化是相近的；HT-29-Gal-obn細(xì)胞與HT-29-Gal細(xì)胞比較，HT-29-Gal-obn細(xì)胞MAA表達(dá)量明顯減少，PNA、GSAII表達(dá)量明顯增加，而SNA、DBA、UEA-I、ConA無明顯變化；HT-29-Gal細(xì)胞與HT-29細(xì)胞比較，HT-29-Gal細(xì)胞GSAII表達(dá)量明顯減少。 2. HT-29、HT-29-Gal、HT-29-Obn和HT-29-Gal-obn細(xì)胞裂解液系列稀釋瓊脂板克隆計(jì)數(shù)顯示，侵襲入HT-29-Obn細(xì)胞和HT-29-Gal-obn細(xì)胞中的EPEC和EHECO157:H7均高于對照的HT-29細(xì)胞和HT-29-Gal細(xì)胞，（P0.05）。 3. qRT-PCR和Western blotting檢測HT-29、shRNA-Ctr/HT-29、shRNA-C2GnT-2/HT-29細(xì)胞中C2GnT-2表達(dá)顯示，shRNA-C2GnT-2/HT-29細(xì)胞C2GnT-2的蛋白、mRNA表達(dá)量均明顯低于HT-29細(xì)胞和shRNA-Ctr/HT-29細(xì)胞。 4.組織化學(xué)染色HT-29、shRNA-Ctr/HT-29、shRNA-C2GnT-2/HT-29細(xì)胞凝集素顯示，shRNA-C2GnT-2/HT-29細(xì)胞與HT-29細(xì)胞和shRNA-Ctr/HT-29細(xì)胞相比較，shRNA-C2GnT-2/HT-29細(xì)胞中MAA表達(dá)量有所減少、SNA表達(dá)量有所增加。 5.在EPEC或EHEC O157:H7感染下，電阻抗測定shRNA-Ctr/HT-29、shRNA-C2GnT-2/HT-29細(xì)胞中電阻變化顯示，shRNA-Ctr/HT-29細(xì)胞和shRNA-C2GnT-2/HT-29細(xì)胞電阻抗值均下降，但shRNA-C2GnT-2/HT-29細(xì)胞電阻下降值明顯高于shRNA-Ctr/HT-29細(xì)胞（P0.05）。 6.在EPEC或EHEC O157:H7感染下，免疫熒光檢測HT-29、shRNA-Ctr/HT-29、shRNA-C2GnT-2/HT-29細(xì)胞緊密鏈接蛋白（ZO-1和Occludin）顯示，shRNA-Ctr/HT-29細(xì)胞和shRNA-C2GnT-2/HT-29細(xì)胞相比較，ZO-1的表達(dá)量、分布連續(xù)性上無明顯差異；Occludin在shRNA-C2GnT-2/HT-29和shRNA-Ctr/HT-29細(xì)胞中均出現(xiàn)顆粒樣聚集，并在細(xì)胞膜的表達(dá)出現(xiàn)不連續(xù)性，即斷裂現(xiàn)象，但Occludin在表達(dá)量上無明顯差異。 7.在EPEC或EHEC O157:H7感染下，ELISA檢測shRNA-Ctr/HT-29和shRNA-C2GnT-2/HT-29細(xì)胞中IL-6和IL-8顯示， shRNA-C2GnT-2/HT-29細(xì)胞和shRNA-Ctr/HT-29細(xì)胞中均未檢測到炎癥因子IL-6和IL-8的表達(dá)。 8. MTT、細(xì)胞劃痕、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測HT-29、shRNA-Ctr/HT-29、shRNA-C2GnT-2/HT-29細(xì)胞生物學(xué)行為顯示，shRNA-C2GnT-2/HT-29細(xì)胞增值能力、生長速度、侵襲能力均高于HT-29細(xì)胞和shRNA-Ctr/HT-29細(xì)胞（P0.05）。 9. Western blotting檢測HT-29、shRNA-Ctr/HT-29、shRNA-C2GnT-2/HT-29細(xì)胞中鏈接蛋白（ZO-1,Occludin,E-cadherin）和凋亡蛋白（Caspase-3）顯示：shRNA-C2GnT-2/HT-29細(xì)胞細(xì)胞鏈接蛋白ZO-1,Occludin,E-cadherin和凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)量與HT-29細(xì)胞和shRNA-Ctr/HT-29細(xì)胞相比，，無明顯變化。 結(jié)論 1.抑制腸上皮細(xì)胞黏蛋白O-型糖鏈的合成導(dǎo)致細(xì)胞糖基化模式的改變。 2.抑制腸上皮細(xì)胞黏蛋白O-型糖鏈的合成導(dǎo)致侵襲入細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌增加。 3.干擾腸上皮細(xì)胞Core2O-型糖鏈的合成導(dǎo)致細(xì)菌侵襲增加，主要是通過改變腸上皮細(xì)胞屏障功能所致。 4.在干擾Core2O-型糖鏈合成的腸上皮細(xì)胞和對照細(xì)胞中，Occludin在細(xì)菌作用下，均出現(xiàn)顆粒樣聚集，并在細(xì)胞膜的表達(dá)出現(xiàn)不連續(xù)性，即斷裂現(xiàn)象。 5.干擾腸上皮細(xì)胞C2GnT-2的合成導(dǎo)致其生長、遷移、侵襲能力均增加。
【關(guān)鍵詞】：O-型糖鏈 benzyl-α-GalNAc Core 2 C2GnT-2
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R57
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• Abstract6-10
• 摘要10-13
• 第一章 前言13-15
• 第二章 黏蛋白 Core 2 O-型糖鏈影響細(xì)菌侵襲腸上皮細(xì)胞的研究15-35
• 2.1 材料15-17
• 2.2 方法17-24
• 2.3 結(jié)果24-33
• 2.4 討論33-35
• 第三章 C2GnT-2 影響結(jié)腸腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的改變35-44
• 3.1 材料35-36
• 3.2 方法36-37
• 3.3 結(jié)果37-41
• 3.4 討論41-44
• 全文總結(jié)44-45
• 參考文獻(xiàn)45-48
• 文獻(xiàn)綜述48-56
• 參考文獻(xiàn)53-56
• 在讀期間發(fā)表的論文56-57
• 致謝57

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉韻;葉鈞;宋麗麗;田音;潘瓊;彭志紅;汪榮泉;;Core 2和Core 4 O-型糖鏈參與大腸桿菌對腸上皮細(xì)胞的黏附與侵襲[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2014年02期

  本文關(guān)鍵詞：黏蛋白Core 2 O-型糖鏈的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：474746