本文關(guān)鍵詞：EGCG和PC-B2對(duì)AFB_1致肝細(xì)胞DNA損傷的保護(hù)作用與機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：黃曲霉毒素(Aflatoxin, AFT)中以黃曲霉毒素B1(AFB1)最常見(jiàn)、毒性最大、致癌性最強(qiáng),主要損害肝臟并易誘發(fā)肝癌,屬于Ⅰ類強(qiáng)致癌物。在抵抗AFB1毒作用的藥物研究中,植物多酚類化學(xué)物(Polyphenols Phytochemicals)愈來(lái)愈受到人們的關(guān)注。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(Epigallocatechin Gallate, EGCG)作為綠茶主要活性成分,具有抗氧化、抗突變、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、提高機(jī)體免疫力的效果,是兒茶素類化合物中生物學(xué)效應(yīng)最強(qiáng)的一種。原花青素B2(PC-B2)是植物界中一類廣泛存在的天然多酚類化合物,屬于強(qiáng)抗氧化劑,可以有效清除人與動(dòng)物體內(nèi)多余的自由基,保護(hù)細(xì)胞及組織免受氧化損傷。PC-B2藥理作用廣泛,具有保護(hù)心血管、預(yù)防高血壓、抗輻射、抗突變、抗腫瘤等作用。本研究擬通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)平臺(tái),探討E GCG與PC-B2對(duì)AFB1染毒后的人胚肝細(xì)胞DNA損傷的保護(hù)作用,具體研究過(guò)程如下：第一部分AFB1對(duì)L-02細(xì)胞生存率、凋亡率及DNA損傷的影響目的探討不同濃度AFB1對(duì)體外培養(yǎng)人胚肝細(xì)胞(L-02細(xì)胞)生存率、凋亡率及DNA損傷的影響。方法體外培養(yǎng)L-02細(xì)胞,采用AFB1進(jìn)行干預(yù),AFB1用藥濃度分別為：0、5、10、20、40、80mg/L AFB1。倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化,用MTT法測(cè)定細(xì)胞的存活率,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,采用單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)(SCGE)觀察細(xì)胞DNA損傷情況。結(jié)果與對(duì)照組比較,10mg/L及以上濃度AFB1干預(yù)48h后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化,低濃度下表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、體積變小,高濃度下細(xì)胞皺縮變?yōu)閳A形,出現(xiàn)大量漂浮細(xì)胞及細(xì)胞碎片,形態(tài)學(xué)變化的程度與AFB1濃度有關(guān)。10mg/L及以上濃度AFB1作用48h后存活率均明顯低于對(duì)照組(P0.05)；5mg/L及以上濃度AFB1作用48h后凋亡率均明顯高于對(duì)照組(P0.05)；且10mg/L及以上濃度AFB1干預(yù)存在劑量-效應(yīng)關(guān)系,隨著AFB1作用濃度的增加,L-02細(xì)胞存活率減少(P0.05),凋亡率增加(P0.05)。SCGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較,AFB1作用L-02細(xì)胞48h后,10mg/L及以上濃度組細(xì)胞彗星尾部DNA百分率、Olive尾距增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),并且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系,隨著AFB1濃度的增加,L-02細(xì)胞的DNA損傷增大。結(jié)論10mg/L及以上濃度AFB1有細(xì)胞毒性、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)以及損傷細(xì)胞的DNA的作用；5mg/L及以上濃度AFB1能提高細(xì)胞凋亡率；隨著AFB1濃度的升高,呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系；40mg/L濃度AFB1能有效抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、造成較嚴(yán)重的細(xì)胞DNA損傷,但不至于立刻導(dǎo)致細(xì)胞死亡,因而40mg/L濃度被選為后續(xù)試驗(yàn)的參考濃度。第二部分EGCG與PC-B2對(duì)AFB1致L-02細(xì)胞生存率、凋亡率、DNA損傷以及Bc1-2、Bax、caspase-3、caspase-9、P53基因表達(dá)的影響目的探討EGCG與PC-B2對(duì)AFB1致體外培養(yǎng)人胚肝細(xì)胞(L-02細(xì)胞)生存率、凋亡率、DNA損傷以及、Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9、P53基因表達(dá)的影響。方法體外培養(yǎng)L-02細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)設(shè)立6組：(1)空白對(duì)照組：L-02細(xì)胞僅給予培養(yǎng)液；(2)溶劑對(duì)照組給予加2%DMSO溶劑的培養(yǎng)液；(3)AFB1染毒組：L-02細(xì)胞經(jīng)40mg/L的AFB1單獨(dú)作用；(4) EGCG組：L-02細(xì)胞在AFB1染毒同時(shí)給予50mg/L的EGCG作用；(5)PC-B2組：L-02細(xì)胞在AFB1染毒同時(shí)給予200 mg/L的PC-B2;(6)EGCG與PC-B2組：L-02細(xì)胞在AFB1染毒同時(shí)給予5Om g/L的EGCG與200 mg/L的PC-B2。以上各組2天換液一次,3-5天傳代一次,一周后,觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化,用MTT法測(cè)定細(xì)胞的存活率,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,采用單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)(SCGE)觀察細(xì)胞DNA損傷情況,采用Western blot法分析Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9、P53 5個(gè)基因的表達(dá)。結(jié)果(1)與對(duì)照組比較,AFB1染毒組能顯著抑制L-02細(xì)胞生長(zhǎng),EGCG與PC-B2均能降低AFB1對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用,使生長(zhǎng)抑制率從61.12%降至42.18%和46.72%; EGCG與PC-B2聯(lián)用則使AFB1對(duì)肝細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率從61.12%降至37.15%。SCGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明EGCG與PC-B2單用／聯(lián)用均能減小AFB1引起的L-02細(xì)胞DNA損傷(P0.05),其彗星Olive尾矩值分別為AFB1染毒組9.72±2.64,EGCG組5.91+1.79,PC-B2組5.36+1.17；EGCG+PC-B2組4.47+1.27。實(shí)驗(yàn)各組L-02細(xì)胞經(jīng)處理后,早期凋亡率(%)分別為空白對(duì)照組2.63±0.28,溶劑對(duì)照組3.01+0.45,AFB1染毒組13.63+3.79,EGCG組8.26±1.67,PC-B2組7.89+1.52,EGCG+PC-B2組4.68±0.51,實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈顯著性差異(P0.05)；與溶劑對(duì)照組相比,AFB1染毒組能上調(diào)caspase-3、 caspase-9的表達(dá)(P0.05),下調(diào)bcl-2/ Bax(P0.05)；而EGCG組與PC-B2組中表明,EGCG與PC-B2單用均能下調(diào)caspase-3、caspase-9的表達(dá)(P0.05),顯著上調(diào)bcl-2/Bax(P0.05),而EGCG與PC-B2兩者聯(lián)用時(shí),對(duì)caspase-3、caspase-9、bcl-2/Bax的影響更為顯著(P0.05)；無(wú)論是EGCG與PC-B2單用還是聯(lián)用,對(duì)P53的表達(dá)水平影響不明顯。結(jié)論AFB1能顯著抑制L-02肝細(xì)胞的生長(zhǎng),并使細(xì)胞的DNA損傷程度加重；EGCG與PC-B2單用或聯(lián)用可提高細(xì)胞的生存率,降低細(xì)胞凋亡率與DNA損傷程度；EGCG與PC-B2對(duì)AFB1長(zhǎng)時(shí)間暴露的L-02細(xì)胞caspase-3、caspase-9基因的表達(dá)顯著下調(diào),bcl-2/B ax比值顯著升高,EGCG與PC-B2能降低AFB1致L-02細(xì)胞DNA損傷與細(xì)胞凋亡率,其作用機(jī)制可能與下調(diào)caspase-3、 caspase-9的表達(dá),升高bcl-2/Bax比值有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：EGCG PC-B2 AFB_1 L-02細(xì)胞 肝細(xì)胞損傷 基因表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R575
【目錄】：

• 個(gè)人簡(jiǎn)歷3-5
• 縮寫(xiě)詞匯中英文對(duì)照表5-6
• 摘要6-9
• ABSTRACT9-14
• 前言14-16
• 第一部分 AFB_1對(duì)L-02細(xì)胞生存率、凋亡率及DNA損傷的影響16-35
• 1 材料與方法17-22
• 2 結(jié)果22-28
• 3 討論28-29
• 參考文獻(xiàn)29-35
• 第二部分 EGCG與PC-B2對(duì)AFB1致L-02細(xì)胞生存率、凋亡率、DNA損傷以及Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9、P53基因表達(dá)的影響35-54
• 1 材料與方法36-45
• 2 結(jié)果45-52
• 3 討論52-54
• 全文總結(jié)54-55
• 參考文獻(xiàn)55-59
• 綜述59-72
• 參考文獻(xiàn)64-72
• 致謝72

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前6條

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  本文關(guān)鍵詞：EGCG和PC-B2對(duì)AFB_1致肝細(xì)胞DNA損傷的保護(hù)作用與機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：445359