發(fā)布時(shí)間：2017-05-31 18:15

  本文關(guān)鍵詞：原發(fā)性膽汁性肝硬化microRNA表達(dá)譜的檢測(cè)及其功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：原發(fā)性膽汁性肝硬化（Primary Biliary Cirrhosis, PBC）是類典型的器官特異性的自身免疫性疾病，以血清中出現(xiàn)高滴度的特異性抗線粒體抗體（Anti-mitochondrialAntibodies,AMAs）、肝內(nèi)小膽管進(jìn)行性破壞、膽汁淤積及肝臟門脈周圍淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等為特征，最終導(dǎo)致肝硬化甚至肝衰竭；盡管也曾報(bào)道年輕患者如兒童發(fā)生PBC的病例，但PBC仍主要累及50-60歲年齡階段的女性，男女發(fā)病率約為1:10；最近篇最新關(guān)于PBC患病率與發(fā)病率的系統(tǒng)性回顧發(fā)現(xiàn)：PBC的年發(fā)病率為0.33-5.8/100,000，而PBC在普通人群中的患病約為1.91-40.2/100,000，且這數(shù)據(jù)在不斷增長(zhǎng)中；對(duì)于中國(guó)的PBC發(fā)病率與患病率當(dāng)前還未有準(zhǔn)確的流行病學(xué)調(diào)查資料，但當(dāng)前有研究證實(shí)在中國(guó)非肝炎性慢性肝病中，PBC約占4.6%，由此可見(jiàn)PBC在中國(guó)并非十分罕見(jiàn)。 目前認(rèn)為PBC的發(fā)病機(jī)制為：遺傳因素與環(huán)境因素共同作用，引起機(jī)體免疫功能紊亂導(dǎo)致淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、肝臟匯管區(qū)發(fā)生炎癥反應(yīng)，在長(zhǎng)期炎癥刺激下，肝臟發(fā)生硬化最終引起肝衰竭；當(dāng)前研究已證實(shí)PBC的特異性自身抗原主要是定位于線粒體內(nèi)膜上的丙酮酸脫氫酶復(fù)合物（PDC）、2-氧戊二酸脫氫酶復(fù)合物（OGDC）、側(cè)鏈二氧酸脫氫酶復(fù)合物（BCOADC）的E2亞基，其中在其發(fā)病過(guò)中發(fā)揮主要作用是丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的E2亞基；雖然人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些自身抗原在免疫介導(dǎo)的膽管損害及其他自身免疫性病理反應(yīng)中具有重要的作用，但對(duì)于PBC具體的發(fā)病機(jī)制目前還未十分清楚。 AMAs作為臨床上診斷PBC的特異性自身免疫性抗體，有著較高的敏感度與特異度，其不僅可以用于診斷PBC還可以預(yù)測(cè)PBC的發(fā)生、發(fā)展，但是并不是所以的PBC患者血清中均出現(xiàn)高滴度的AMA，有研究發(fā)現(xiàn)約5%-10%的PBC患者血清AMA為陰性；此外，血清中的免疫球蛋白（IgM），ANA以及gp210抗體都對(duì)PBC的診斷有著重要的輔助作用，但是診斷效能有待提高；而病理診斷是臨床診斷PBC病人的金標(biāo)準(zhǔn)，但肝穿刺的高危險(xiǎn)性限制其在臨床上的廣泛開(kāi)展，PBC的當(dāng)前的診斷主要限于臨床癥狀與血清學(xué)指標(biāo)。 對(duì)于PBC的治療，臨床上仍沒(méi)有十分有效的方法，熊去氧膽酸是當(dāng)前經(jīng)FDA批準(zhǔn)的唯類治療PBC的藥物，但是UDCA可以明顯改善膽汁淤積的癥狀，但無(wú)法從根本上治療PBC，也無(wú)法阻斷疾病的進(jìn)展；PBC發(fā)展到晚期的唯治療方法就是肝移植，但是臨床肝臟器官來(lái)源有限及高額的手術(shù)費(fèi)用及術(shù)后免疫抑制劑的治療，臨床上肝移植難以在PBC患者中普及應(yīng)用。 至從人類第次使用原發(fā)性膽汁性肝硬化這術(shù)語(yǔ)已有50多年，在過(guò)去半個(gè)多世紀(jì)的研究歷程中人類也取得了許多成績(jī)，，如AMA的發(fā)現(xiàn)、特異性自身抗原的克隆、PBC診斷標(biāo)準(zhǔn)的建立、UDCA治療作用、GWAS研究等，人們因此也更加清楚的認(rèn)識(shí)了PBC這疾��；但是在人類戰(zhàn)勝PBC的研究道路上，仍面臨著許多挑戰(zhàn)與有待解決的問(wèn)題如PBC具體的發(fā)病機(jī)制、更高診斷效能的標(biāo)志物、以及新的特異性治療靶點(diǎn)。 microRNAs作為類內(nèi)源性的短序列非編碼的RNA，作用于基因的轉(zhuǎn)錄后水平，通過(guò)與mRNA的3’端非翻譯區(qū)的特異性結(jié)合以達(dá)到翻譯抑制或降解mRNA的目的，進(jìn)而調(diào)控機(jī)體細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等系列物學(xué)活動(dòng)。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)在自身免疫性疾病中microRNA的表達(dá)譜存在異常表達(dá)，如已發(fā)現(xiàn)在SLE患者PBMC中存在16個(gè)microRNA異常，而狼瘡腎炎組織中有66個(gè)microRNA的表達(dá)有異常,這些結(jié)果提示microRNA的異�？赡芘c自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制有著重要關(guān)系。除了在SLE中發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)的microRNA,在其它自身免疫性疾病如在類風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、潰瘍性結(jié)腸炎、銀屑病等疾病的外周血或病變組織中均發(fā)現(xiàn)存在相應(yīng)的microRNA異常，如microRNA-146、microRNA-155、microRNA-326等與機(jī)體免疫功能相關(guān)的microRNAs；但是當(dāng)前對(duì)于PBC的microRNA表達(dá)譜以及microRNA在PBC發(fā)病機(jī)制中的作用還未十分清楚，因此，本研究旨在探索PBC患者中microRNA表達(dá)譜的異常及其在PBC發(fā)病機(jī)制中的作用。 第一部分PBC患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中異常microRNA的檢測(cè) 在此部分研究中，我們首先用microRNA芯片篩選出PBC病人與健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞中異常的microRNA表達(dá)譜，芯片結(jié)果顯示與健康正常組相比PBC患者的PBMCs中共有17個(gè)異常表達(dá)的microRNAs，其中11個(gè)表達(dá)上調(diào)，6個(gè)表達(dá)下調(diào)；隨后我們選擇其中異常表達(dá)的6個(gè)microRNAs(miR-15a-5p,miR-20a-5p, miR-140-3p, miR-106b-5p, miR-3654, miR-181a-5p)在9例健康對(duì)照組與9例PBC患者組的PBMCs中進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果與芯片結(jié)果保持致，從而說(shuō)明microRNA表達(dá)譜芯片結(jié)果的可靠性；該部分研究結(jié)果說(shuō)明PBC患者PBMCs中確實(shí)存在有異常表達(dá)的microRNA。 第二部分異常表達(dá)的microRNA的功能分析 通過(guò)第部分我們得到在PBC中異常表達(dá)的17個(gè)microRNA，隨后我們進(jìn)行了相關(guān)的生物信息學(xué)分析；首先，對(duì)異常表達(dá)的microRNA的靶基因的預(yù)測(cè)，分別通過(guò)搜索miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)、TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)差異microRNA調(diào)控的所有靶點(diǎn)，對(duì)靶基因進(jìn)行組織特異性篩選，得到特異表達(dá)于外周血中的靶基因；隨后對(duì)靶基因進(jìn)行GO分析得到靶基因參與的顯著靶向性功能，發(fā)現(xiàn)上調(diào)microRNA主要調(diào)控的功能有信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞分化、凋亡等功能，而下調(diào)的microRNA主要的調(diào)控功能有信號(hào)傳導(dǎo)、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、染色體修飾、細(xì)胞增殖等功能；同樣為了進(jìn)步闡明異常表達(dá)的microRNA參與的信號(hào)通路，我們進(jìn)行了pathway分析，發(fā)現(xiàn)這些異常表達(dá)的microRNA與主要影響細(xì)胞內(nèi)吞作用、MAPK信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路以及Wnt信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路等；隨后，根據(jù)GO功能分析及Pathway顯著性分析，得到顯著性GO及Pathway所屬靶基因，利用這些靶基因與microRNA的靶向調(diào)控關(guān)系，構(gòu)建microRNA-Gene-Work進(jìn)步顯示二者之間靶向關(guān)系；該部分研究結(jié)果顯示這些異常microRNA參與了許多細(xì)胞功能與信號(hào)通路的調(diào)控，而這些信號(hào)通路與細(xì)胞功能也被研究證實(shí)在PBC的發(fā)病中有著重要的作用。 第三部分microRNA-106b-5p靶點(diǎn)的驗(yàn)證 在此部分研究中，基于第部分得到的17個(gè)異常表達(dá)的microRNA，我們選擇microRNA-106b-5p做進(jìn)步的靶點(diǎn)探索；首先，我們?cè)谠l(fā)性膽汁性肝硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征以及病毒性肝炎肝硬化患者中檢驗(yàn)PBMCs中microRNA-106b-5p的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在PBC患者中microRNA-106b-5p表達(dá)顯著升高（P0.05）；隨后我們選擇THp1細(xì)胞用于microRNA-106b-5p靶點(diǎn)研究中，，RT-PCR及Western blot結(jié)果均顯示轉(zhuǎn)染mimic及inhibitor后JAK1水平發(fā)生相應(yīng)的改變，此外，熒光素酶報(bào)告基因載體也證實(shí)了二者的靶向作用關(guān)系；該部分研究結(jié)果說(shuō)明microRNA-106b-5p可以靶向作用于JAK1，調(diào)控其表達(dá)水平。 綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了PBC患者異常表達(dá)的microRNA表達(dá)譜并探索了其在PBC發(fā)病機(jī)制中的功能作用，microRNA-106b-5p作為類上調(diào)表達(dá)的microRNA可以靶向作用于JAK1調(diào)控其表達(dá)；此外，這些異常的microRNA可以進(jìn)步解釋PBC的發(fā)病機(jī)制并可能成為新的疾病標(biāo)記物及治療靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：microRNA 原發(fā)性膽汁性肝硬化 microRNA-106b-5p JAK1
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R575.2
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 中英文縮略詞12-13
• 第一部分 PBC患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中microRNA芯片檢測(cè)及RT-PCR驗(yàn)證13-23
• 一、材料與方法13-18
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果18-21
• 討論21-23
• 第二部分 異常表達(dá)microRNA的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及功能分析23-34
• 一、材料與方法23-25
• 二、結(jié)果25-31
• 討論31-34
• 第三部分 microRNA-106b-5p靶點(diǎn)的驗(yàn)證34-49
• 一、實(shí)驗(yàn)材料與方法34-42
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果42-48
• 討論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-52
• 全文總結(jié)52-53
• 綜述53-64
• 參考文獻(xiàn)58-64
• 研究生期間發(fā)表論文64-65
• 致謝65-66

【共引文獻(xiàn)】

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中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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  本文關(guān)鍵詞：原發(fā)性膽汁性肝硬化microRNA表達(dá)譜的檢測(cè)及其功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：410274