非酒精性脂肪肝疾病的發(fā)展過程中,氧化應(yīng)激在非酒精性脂肪肝脂質(zhì)過氧化作用中起到關(guān)鍵的作用。研究表明,當(dāng)去除病因(高脂高糖飲食)后,肝臟的脂質(zhì)積累可自發(fā)逆轉(zhuǎn)。芳香受體(Aryl hydrocarbon receptor;AHR)是一種配體激活的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子,多環(huán)芳香烴化物苯并芘(Benzo[a]pyrene;BaP)是一種廣泛認(rèn)知的AHR激動(dòng)劑,當(dāng)激動(dòng)劑與芳香受體結(jié)合后,AHR轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核的位置與ARNT構(gòu)成二聚體,繼而形成的二聚體與細(xì)胞色素P4501A1酶(Cytochrome P450 1A1;CYP1A1)蛋白合成的啟動(dòng)基因連接,激發(fā)CYP1A1蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程。CYP1A1是一種重要的調(diào)節(jié)活性氧生成的酶。研究顯示,CYP1A1在非酒精性脂肪肝中的蛋白表達(dá)是升高的,但是其在非酒精性脂肪肝中的起到什么樣的作用還不清楚。綜合以上的文獻(xiàn),本課題意在說明CYP1A1在非酒精性脂肪肝起到催化脂質(zhì)過氧化的作用,沉默CYP1A1在非酒精性脂肪肝中的高表達(dá),能夠減弱非酒精性脂肪肝中的脂質(zhì)過氧化作用。為了深化對CYP1A1在非酒精性脂肪肝中作用的探討,本課題首先檢測了CYP1A1在非酒精性脂肪肝進(jìn)展期...

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【學(xué)位級別】：碩士

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中文摘要
Abstract
前言
1.實(shí)驗(yàn)材料與儀器
    1.1 材料與試劑
        1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞
        1.1.2 主要試劑
    1.2 儀器
    1.3 主要試劑和溶液的配制
2.實(shí)驗(yàn)方法
    2.1 小鼠動(dòng)物模型的建立
    2.2 小鼠肝組織病理學(xué)檢測
        2.2.1 HE染色
        2.2.2 肝指數(shù)的測定
        2.2.3 血清ALT和AST測定
    2.3 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)和傳代
    2.4 細(xì)胞水平逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)
    2.5 MTT實(shí)驗(yàn)
    2.6 油酸誘導(dǎo)的脂肪變性
    2.7 細(xì)胞的油紅染色
    2.8 甘油三脂的測量
    2.9 CYP1A1-siRNA轉(zhuǎn)染油酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞
    2.10 BaP刺激作用
    2.11 細(xì)胞超氧化物歧化酶(SOD)的測定
    2.12 細(xì)胞活性氧(ROS)的測定
    2.13 肝臟/細(xì)胞丙二醛(MDA)的測定
    2.14 細(xì)胞4-羥基壬烯酸(HNE)的測定
    2.15 Real-timePCR實(shí)驗(yàn)
        2.15.1 細(xì)胞總RNA的提取
        2.15.2 反轉(zhuǎn)錄
        2.15.3 RealtimePCR測定CYP1A1和CYP1A2mRNA的表達(dá)變化
    2.16 細(xì)胞/組織總蛋白的提取
    2.17 BCA蛋白定量
    2.18 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)
    2.19 統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析處理
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3.1 CYP1A1在非酒精性脂肪肝肝組織中及逆轉(zhuǎn)肝組織中的表達(dá)變化
        3.1.1 小鼠肝臟外觀
        3.1.2 小鼠肝組織HE染色
        3.1.3 小鼠肝臟指數(shù)
        3.1.4 小鼠血清ALT及AST的含量變化
        3.1.5 小鼠非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝逆轉(zhuǎn)組肝組織中CYP1A1蛋白的表達(dá)變化
        3.1.6 丙二醛(MDA)在小鼠脂質(zhì)積累模型組和脂質(zhì)積累逆轉(zhuǎn)組中的含量變化
    3.2 細(xì)胞水平體外造脂質(zhì)積累模型以及CYP1A1在脂質(zhì)積累模型中的表達(dá)情況
        3.2.1 MTT法檢測不同濃度的油酸造模液對HepG2細(xì)胞増殖的影響
        3.2.2 油酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞造體外脂質(zhì)積累模型的油紅O染色結(jié)果和甘油三酯含量
        3.2.3 不同時(shí)間點(diǎn)CYP1A1蛋白在油酸刺激的HepG2細(xì)胞的表達(dá)變化
        3.2.4 不同時(shí)間點(diǎn)CYP1A1mRNA在油酸刺激的HepG2細(xì)胞中表達(dá)變化
    3.3 體外細(xì)胞逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)
        3.3.1 CYP1A1在逆轉(zhuǎn)的HepG2細(xì)胞中的表達(dá)變化
        3.3.2 脂質(zhì)積累模型組和脂質(zhì)積累逆轉(zhuǎn)組中脂質(zhì)過氧化水平的變化
    3.4 CYP1A1-siRNA對油酸刺激的HepG2細(xì)胞中CYP1A1和CYP1A2表達(dá)的影響
        3.4.1 CYP1A1-siRNA對油酸刺激HepG2細(xì)胞中CYP1A1和CYP1A2蛋白表達(dá)的影響
        3.4.2 CYP1A1-siRNA對油酸刺激的HepG2細(xì)胞中CYP1A1和CYP1A2mRNA表達(dá)的影響
    3.5 沉默CYP1A1的表達(dá)降低脂質(zhì)積累模型中的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化作用
        3.5.1 CYP1A1-siRNA對油酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞中ROS和SOD水平的影響
        3.5.2 CYP1A1-siRNA對HepG2細(xì)胞中MDA和HNE水平的影響
    3.6 苯并芘(BaP)通過刺激CYP1A1的高表達(dá)加重油酸刺激的HepG2細(xì)胞中的脂質(zhì)過氧化作用
        3.6.1 在苯并芘(BaP)處理HepG2細(xì)胞中CYP1A1的mRNA和蛋白的表達(dá)變化
        3.6.2 苯并芘(BaP)對HepG2細(xì)胞中MDA和SOD的影響
4.討論
5.結(jié)論
參考文獻(xiàn)
個(gè)人簡歷
致謝
綜述
    參考文獻(xiàn)



本文編號：3937613