本研究利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了hKD/APP真核表達(dá)載體,電轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33后,篩選出穩(wěn)定高效分泌表達(dá)的rhKD/APP工程菌株。經(jīng)SDS-PAGE、離子交換層析、疏水層析、對(duì)胰蛋白酶的抑制特性和質(zhì)譜測(cè)定,證明rhKD/APP與天然hKD/APP具有相同的序列和理化性質(zhì)。利用80 L發(fā)酵罐優(yōu)化發(fā)酵條件,采用甲醇誘導(dǎo)批式發(fā)酵,大量制備和純化rhKD/APP用于生物活性的研究。用Seglen法分離大鼠原代肝細(xì)胞,分別在含2 %新生牛血清、rhKD/APP、BPTI及8 %新生牛血清條件培養(yǎng)基下觀察rhKD/APP對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞的影響。結(jié)果表明,添加rhKD/APP組的原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞在培養(yǎng)的第96 h存活的細(xì)胞數(shù)量顯著高于2%新生牛血清組,在形態(tài)上仍具有典型的肝細(xì)胞樣結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)了rhKD/APP具有延長(zhǎng)原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞存活時(shí)間的生物學(xué)效應(yīng),其有效劑量和最高有效劑量分別為2.5μg·ml-1、10μg·ml-1。rhKD/APP在藥效學(xué)研究方面,我們建立了小鼠急性CCl4肝損傷模型和大鼠慢性CCl4肝損傷模型,觀察rhKD/APP對(duì)CCl4肝損傷小鼠血清酶及對(duì)肝臟組織病理變化的影響。...

【文章頁數(shù)】：135 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
前言
第一章 文獻(xiàn)回顧
    第一節(jié) Kunitz 型蛋白酶抑制劑 BPTI
    第二節(jié) 人 Kunitz 型蛋白酶抑制劑hKD/APP
第二章 rhKD/APP 畢赤酵母高效分泌表達(dá)體系的建立和鑒定
    第一節(jié) 材料和方法
    第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    第三節(jié) 討論
第三章 rhKD/APP 大規(guī)模發(fā)酵及純化
    第一節(jié) 材料和方法
    第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    第三節(jié) 討論
第四章 rhKD/APP 對(duì)原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞存活的影響
    第一節(jié) 材料和方法
    第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    第三節(jié) 討論
第五章 rhKD/APP 對(duì)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用
    第一節(jié) 材料和方法
    第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    第三節(jié) 討論
第六章 rhKD/APP 對(duì)大鼠慢性肝損傷的保護(hù)作用
    第一節(jié) 材料和方法
    第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    第三節(jié) 討論
研究總結(jié)
參考文獻(xiàn)
附錄一 rhKD/APP 序列分析
附錄二 rhKD/APP 陽離子交換層析純化圖譜
附錄三 rhKD/APP 質(zhì)譜分析圖
附錄四 大鼠肝細(xì)胞光鏡圖片
附錄五 病理學(xué)圖片
攻讀博士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及其它成績(jī)
致謝
中文摘要
英文摘要



本文編號(hào)：3829532