發(fā)布時間：2017-05-04 10:02

  本文關(guān)鍵詞：硫化氫對小鼠原代肝細(xì)胞脂肪合成和分解的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是代謝綜合癥中常見的一種疾病,現(xiàn)已成為歐美等發(fā)達(dá)國家和我國慢性肝病的重要病因,目前還沒有理想的預(yù)防和治療藥物。在NAFLD的發(fā)病機(jī)制中,由胰島素抵抗及其它因素引起的肝臟內(nèi)脂質(zhì)合成增加及沉積在疾病的發(fā)生發(fā)展中占據(jù)重要地位。硫化氫(Hydrogen sulfide),化學(xué)分子式為H2S,是一種能在人類和哺乳動物細(xì)胞內(nèi)合成的氣體分子遞質(zhì),可調(diào)控多種生理及病理生理過程。有研究顯示,內(nèi)源性H2S或外源性H2S供體的補(bǔ)充,可在生理或病理生理條件下影響肝臟正常的脂質(zhì)代謝。然而,H2S改變及控制肝臟脂質(zhì)代謝的機(jī)制尚不清楚。有文獻(xiàn)報道在大鼠脂肪細(xì)胞中,抑制胱硫醚γ裂解酶(Cystathionine-gamma-lyase,CSE)/H2S系統(tǒng)可通過PKA-脂肪包被蛋白/激素敏感性脂肪酶(Hormone sensitive lipase,HSL)途徑增強(qiáng)脂肪分解作用,增加血脂水平,從而使肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)負(fù)荷增加,患NAFLD風(fēng)險增加。而給予H2S供體則會降低脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂肪分解作用,這樣就有可能降低NAFLD風(fēng)險。由此課題組推測,外源性H2S可能會影響到肝細(xì)胞內(nèi)脂肪的合成及分解代謝。肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度蓄積可以抑制細(xì)胞自噬,H2S作為一種氣體分子遞質(zhì),可激活細(xì)胞自噬,但是否能通過改變肝細(xì)胞的自噬水平來調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的脂肪代謝目前還不清楚。目的:探究H2S對肝細(xì)胞脂肪合成和分解代謝的影響以及細(xì)胞自噬對肝細(xì)胞脂肪變性的影響,為進(jìn)一步了解H2S在NAFLD的作用及開發(fā)H2S供體治療藥物提供理論依據(jù)。方法:兩步原位灌流法分離培養(yǎng)C57BL/6小鼠原代肝細(xì)胞,體外用油酸(Oleic acid,OA)誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性模型。研究H2S對肝細(xì)胞脂質(zhì)合成影響時細(xì)胞分四組:對照組,給予等體積的培養(yǎng)液和10%的BSA,用于替換模型組所用的含1.2mmol/L的油酸(溶于10%的BSA)的培養(yǎng)液;模型組,用含1.2mmol/L油酸(溶于10%的BSA)的培養(yǎng)液孵育原代肝細(xì)胞48h;H2S組和PAG組是指用含1.2mmol/L油酸(溶于10%的BSA)的培養(yǎng)液孵育原代肝細(xì)胞的同時分別給予1mM GYY4137和200μM PAG處理48h。油紅染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴變化情況,比色法檢測細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)含量,觀察脂肪分解的實驗也分四組:對照組,給予等體積的培養(yǎng)液和10%的BSA,用于替換模型組所II用的含1.2mmol/L油酸(溶于10%的BSA)的培養(yǎng)液;模型組,用含1.2mmol/L油酸(溶于10%的BSA)的培養(yǎng)液孵育原代肝細(xì)胞48h;H2S組和PAG組是用含1.2mmol/L油酸(溶于10%的BSA)的培養(yǎng)液孵育原代肝細(xì)胞48h,然后換無血清無酚紅的RPMI1640培養(yǎng)液同時分別給予1mM GYY4137和200μM PAG處理6h。實驗結(jié)束時,收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液檢測其中甘油含量,取細(xì)胞爬片做LC3免疫熒光,拍攝相差圖片;同時離心收集細(xì)胞制作電鏡標(biāo)本;用Western blotting方法檢測細(xì)胞中LC3A/B、HSL和p-HSL的蛋白表達(dá)量。結(jié)果:1.用含油酸濃度為1.2mmol/L的培養(yǎng)液誘導(dǎo)肝細(xì)胞48h,油紅染色顯示細(xì)胞體積增大,輪廓模糊,胞質(zhì)中有大量脂滴形成,小鼠原代肝細(xì)胞脂肪變性模型建立成功。2.在觀察脂肪合成的實驗中,與對照組相比,模型組肝細(xì)胞中甘油三酯含量明顯增高(P0.05);而與模型組相比,H2S組和PAG組肝細(xì)胞中TG含量無明顯變化。3.在觀察脂肪分解的實驗中,與對照組相比,模型組甘油釋放量顯著增加(P0.05),,H2S組與模型組相比甘油釋放量顯著減少(P0.05).Western blotting結(jié)果顯示,與對照組相比,模型組HSL的磷酸化水平明顯升高(P0.05);H2S組與模型組相比,HSL的磷酸化水平顯著降低(P0.05)。4.LC3免疫熒光、Western blotting結(jié)果顯示,H2S促進(jìn)肝脂肪變性細(xì)胞LC3熒光顆粒和蛋白表達(dá)增加,相差顯微鏡下顯示細(xì)胞內(nèi)空泡增多,電鏡顯示自噬溶酶體數(shù)量增加。這些結(jié)果表明,H2S能夠促進(jìn)原代肝脂肪變性細(xì)胞自噬,促進(jìn)脂質(zhì)的自噬分解。結(jié)論:1.外源性H2S供體GYY4137可通過降低HSL的磷酸化水平,減少脂肪變性肝細(xì)胞的脂質(zhì)細(xì)胞溶質(zhì)分解。2.H2S能夠促進(jìn)脂肪變性肝細(xì)胞的脂質(zhì)自噬,加速細(xì)胞的脂質(zhì)自噬分解。
【關(guān)鍵詞】：硫化氫 原代肝細(xì)胞 脂肪代謝 自噬
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R575.5
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 前言12-14
• 1 材料、試劑和儀器14-24
• 1.1 實驗動物14
• 1.2 主要試劑14-16
• 1.3.主要試劑配制16-21
• 1.3.1 肝臟灌流液(無Ca~(2+)/Mg~(2+) HBSS液，pH 7.4)的配方16
• 1.3.2 肝組織消化液的配方16-17
• 1.3.3 膠原酶溶液的配制17
• 1.3.4 原代肝細(xì)胞培養(yǎng)基的配制17
• 1.3.5 鼠尾膠原工作液的配制17
• 1.3.6 鼠尾膠原涂抹板的制作17
• 1.3.7 MTT工作液的配制17
• 1.3.8 臺盼蘭溶液的配制17-18
• 1.3.9 制備肝細(xì)胞脂肪變性誘導(dǎo)液18
• 1.3.10 1×磷酸緩沖鹽溶液（PBS）的配制18
• 1.3.11 1×Tris-Glycine緩沖溶液的配制18
• 1.3.12 5×蛋白上樣緩沖溶液的配制18-19
• 1.3.13 SDS-PAGE電泳相關(guān)溶液的配制19-21
• 1.3.14 免疫印跡相關(guān)溶液配制21
• 1.4 主要實驗儀器21-24
• 2 實驗方法與步驟24-30
• 2.1 小鼠原代肝細(xì)胞的獲取和培養(yǎng)24
• 2.2 MTT法檢測不同濃度油酸對小鼠原代肝細(xì)胞細(xì)胞活性的影響24
• 2.3 實驗分組24-25
• 2.4 油紅染色25
• 2.5 細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量的檢測25
• 2.6 細(xì)胞甘油釋放量的檢測25-26
• 2.7 BCA法測定蛋白濃度26
• 2.8 蛋白免疫印記法（WESTERN BLOTTING）檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)26-29
• 2.8.1 蛋白的提取26-27
• 2.8.2 BCA法測定蛋白濃度27
• 2.8.3 蛋白濃度的調(diào)節(jié)27
• 2.8.4 SDS-PAGE凝膠電泳27-29
• 2.9 免疫熒光檢測細(xì)胞內(nèi)LC3顆粒熒光29
• 2.10 透射電鏡標(biāo)本的制備29
• 2.11 統(tǒng)計學(xué)分析29-30
• 3 結(jié)果30-38
• 3.1 小鼠原代肝細(xì)胞脂肪變性模型建立的條件30-31
• 3.1.1 MTT法檢測細(xì)胞活性選擇誘導(dǎo)液中油酸的適宜濃度30
• 3.1.2 油紅O染色觀察不同濃度油酸對肝細(xì)胞脂滴積累情況30-31
• 3.2 H_2S對肝細(xì)胞脂肪合成的影響31-32
• 3.2.1 H_2S對肝細(xì)胞脂滴的影響31-32
• 3.2.2 H_2S對肝細(xì)胞甘油三酯含量的影響32
• 3.3 H_2S對肝細(xì)胞脂肪分解的影響32-34
• 3.3.1 H_2S對肝細(xì)胞甘油釋放量的影響33
• 3.3.2 H_2S對肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)激素敏感性脂肪酶蛋白表達(dá)量的影響33-34
• 3.4 H_2S對肝細(xì)胞自噬的影響34-38
• 3.4.1 H_2S對肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積和空泡形成的影響34-35
• 3.4.2 H_2S對肝細(xì)胞自噬標(biāo)志物L(fēng)C3熒光顆粒的影響35
• 3.4.3 H_2S對肝細(xì)胞LC3Ⅰ和LC3Ⅱ蛋白表達(dá)的影響35-36
• 3.4.4 H_2S對肝細(xì)胞自噬體和自噬溶酶體的影響36-38
• 4 討論38-44
• 5.結(jié) 論44-46
• 參考文獻(xiàn)46-50
• 文獻(xiàn)綜述50-62
• 參考文獻(xiàn)57-62
• 附錄62-64
• 致謝64-66
• 碩士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文66-67

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