肝臟作為人體最大的內(nèi)臟器官,具有重要的消化和代謝功能,承擔(dān)著分泌膽汁、參與糖、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝過程、分解代謝有毒物質(zhì)的功能。它具有特殊的血液循環(huán)系統(tǒng),能夠接受來自門靜脈和肝動脈的雙重血液供應(yīng)。肝小葉是肝臟的基本結(jié)構(gòu)單位,肝細胞在其中呈放射狀圍繞中央靜脈排列形成肝板結(jié)構(gòu),肝板之間是肝血竇。小于100nm的顆粒物可以高效的從血管中進入肝實質(zhì)細胞。肝臟特殊的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)以及其重要的生理學(xué)功能,使得肝臟成為基因治療理想的靶器官。隨著分子和細胞生物學(xué)、病毒學(xué)和免疫學(xué)的不斷發(fā)展,眾多肝臟疾病的分子遺傳發(fā)病機制得以解釋,除傳統(tǒng)的肝細胞移植外,針對眾多遺傳性或獲得性肝臟疾病的基因治療成為重要手段,具有廣泛的應(yīng)用前景。肝臟的基因治療面臨的最大難題是如何高效安全的將治療基因?qū)敫渭毎?并能夠長期有效表達。因此,對應(yīng)用于肝臟基因治療的載體系統(tǒng)進行研究具有重大意義�；蛑委熭d體系統(tǒng)的選擇,既要考慮基因傳遞的效率和特異性,治療基因的表達時相,也需要考慮載體進入宿主后所引起的免疫反應(yīng)以及載體所引起的副作用反應(yīng)。理想化的肝臟基因治療載體需要能夠特異性的傳遞治療基因到肝臟局部,能夠?qū)崿F(xiàn)在靜息態(tài)的肝細胞中長期穩(wěn)定表達治... 

【文章來源】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)安徽省 211工程院校 985工程院校

【文章頁數(shù)】：126 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
符號說明
圖序
表序
第一章 緒論靶向肝臟的基因治療
    1.1 肝臟基因治療概述
        1.1.1 肝臟基因治療的概念
        1.1.2 肝臟基因治療的策略
        1.1.3 肝臟基因治療的疾病應(yīng)用
        1.1.4 肝臟基因治療需要考慮的關(guān)鍵問題
        1.1.5 肝臟基因治療的前景與展望
    1.2 肝臟的靶向基因治療技術(shù)
        1.2.1 肝臟基因治療的載體系統(tǒng)
        1.2.2 靶向肝細胞定位表達的基因治療載體
        1.2.3 RNA干擾技術(shù)在肝臟靶向基因治療中的應(yīng)用
        1.2.4 多功能基因治療載體的發(fā)展和改進
        1.2.5 肝臟基因治療的候選基因靶點
第二章 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗動物
        2.1.2 細胞及培養(yǎng)試劑材料
        2.1.3 質(zhì)粒
        2.1.4 質(zhì)粒制備抽提試劑盒
        2.1.5 載體構(gòu)建相關(guān)材料及試劑
        2.1.6 病毒載體構(gòu)建及病毒制備試劑
        2.1.7 真核轉(zhuǎn)染試劑
        2.1.8 熒光素酶報告基因檢測試劑
        2.1.9 小鼠肝實質(zhì)細胞分離相關(guān)試劑和材料
        2.1.10 小鼠單個核細胞分離相關(guān)試劑和材料
        2.1.11 流式細胞術(shù)檢測抗體
        2.1.12 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)檢測試劑
        2.1.13 肝組織病理切片及蘇木素-伊紅染色試劑
        2.1.14 細胞因子ELISA檢測試劑盒
        2.1.15 X-Gal染色檢測bacterial galactosidase(LacZ)活性
        2.1.16 RT-PCR 及 real-time qPCR 試齊ij
        2.1.17 其他試劑及材料
    2.2 實驗儀器及設(shè)備
        2.2.1 小鼠手術(shù)器械
        2.2.2 小鼠肝實質(zhì)細胞、淋巴細胞分離器械
        2.2.3 細胞培養(yǎng)儀器設(shè)備
        2.2.4 流式細胞儀
        2.2.5 病理切片儀器設(shè)備
        2.2.6 分子克隆儀器設(shè)備
        2.2.7 其他儀器設(shè)備
    2.3 實驗方法
        2.3.1 載體構(gòu)建及分子克隆
        2.3.2 真核細胞的轉(zhuǎn)染
        2.3.3 真核貼壁細胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)與凍存
        2.3.4 細胞計數(shù)
        2.3.5 復(fù)制缺陷型腺病毒載體質(zhì)粒構(gòu)建、包裝及擴增純化重組腺病毒
        2.3.6 高壓尾靜脈注射
        2.3.7 冰凍切片技術(shù)
        2.3.8 熒光素酶報告基因檢測
        2.3.9 X-Gal染色檢測bacterial galactosidase(LacZ)活性
        2.3.10 小動物成像系統(tǒng)觀察腺病毒體內(nèi)感染
        2.3.11 血清轉(zhuǎn)氨酶ALT測定(賴氏法)
        2.3.12 ELISA測定細胞因子
        2 3.13 肝組織病理切片及H-E染色
        2.3.14 小鼠肝實質(zhì)細胞分離
        2.3.15 小鼠單個核細胞分離
        2.3.16 FACS檢測細胞表面標(biāo)志
        2.3.17 小鼠急性肝損傷模型(腺病毒感染、PolyⅠ：C/D-GalN注射)
        2.3.18 統(tǒng)計學(xué)分析
第三章 結(jié)果與討論
    3.1 引言
    3.2 肝細胞特異性多功能載體的構(gòu)建與驗證
        3.2.1 肝細胞特異性啟動子的選擇
        3.2.2 肝細胞特異性啟動子與CMV啟動子的比較
        3.2.3 肝細胞特異性RNA干擾的實現(xiàn)
        3.2.4 肝細胞特異性多功能載體的構(gòu)建與驗證
    3.3 肝臟靶向性多功能載體有效抑制腺病毒引起的肝臟損傷
        3.3.1 高劑量腺病毒誘導(dǎo)的急性肝損傷
        3.3.2 聯(lián)合干擾FKN和CCL5有效抑制高劑量腺病毒誘導(dǎo)的急性肝損傷
        3.3.3 聯(lián)合干擾FKN和表達huIL-10有效抑制高劑量腺病毒誘導(dǎo)的急性肝損傷
        3.3.4 同時干擾FKN/CCL5、表達huIL-10高效抑制高劑量腺病毒誘導(dǎo)的急性肝損傷
        3.3.5 肝臟靶向性多功能載體在腺病毒誘導(dǎo)急性肝損傷模型中的功能驗證
        3.3.6 肝臟靶向性多功能載體高效抑制高劑量腺病毒誘導(dǎo)的急性肝損傷
        3.3.7 肝臟靶向性多功能載體能維持長期的保護效果
        3.3.8 肝臟靶向性多功能載體能通過腺病毒進行功能傳遞
    3.4 肝臟靶向性多功能載體抑制Poly Ⅰ：C/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷
        3.4.1 肝臟靶向性多功能載體在poly Ⅰ：C/D-GalN誘導(dǎo)急性肝損傷模型中的功能驗證
        3.4.2 肝臟靶向性多功能載體高效抑制Poly Ⅰ：C/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷
    3.5 討論
        3.5.1 肝臟靶向性基因治療載體的研究進展
        3.5.2 基于microRNA結(jié)構(gòu)的第二代RNA干擾載體
        3.5.3 肝臟靶向性多功能載體在肝臟疾病中的優(yōu)勢
        3.5.4 肝臟基因治療的前景與展望
參考文獻
致謝
攻讀博士學(xué)位期間的主要研究成果
    發(fā)表和擬發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況
    發(fā)明專利
    攻讀博士學(xué)位期間參加參加學(xué)術(shù)會議
    攻讀博士學(xué)位期間所獲得獎勵



本文編號：3435983