本文關(guān)鍵詞：Locostatin對(duì)肝纖維化小鼠肝臟膠原代謝的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：肝纖維化(hepatic fibrosis, HF)是由各種致病因子如病毒、酒精、化學(xué)藥物等引起慢性肝細(xì)胞損傷,導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)過(guò)度沉積,纖維結(jié)締組織異常增生的一個(gè)病理過(guò)程。肝纖維化是肝炎發(fā)展為肝硬化、肝癌的必經(jīng)階段,因此預(yù)防、治療甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化成為慢性肝病研究的重點(diǎn)。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells, HSCs)與肝纖維化的形成密切相關(guān),當(dāng)肝臟受到損傷刺激時(shí),靜止?fàn)顟B(tài)的HSCs轉(zhuǎn)化為激活狀態(tài)的肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞(myofibroblast cells, MFCs),引起ECM合成及降解異常,導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)和功能的改變。ECM的主要成份是膠原,在肝纖維化中主要以Ⅰ、Ⅲ型膠原明顯增加為主。膠原代謝受到基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs)的調(diào)節(jié)。因此HSCs的活化是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)。肝纖維化的形成伴隨著Raf-1/MEK/ERK1,2信號(hào)通路的激活,該通路的激活可以促進(jìn)HSCs的增殖、分化和遷移。Raf激酶抑制蛋白(raf kinase inhibitor protein, RKIP)是磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白家族(phosphatid-ylethanolalmine binding proteins, PEBPs)中的成員,從植物到哺乳動(dòng)物都有發(fā)現(xiàn),可以調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。RKIP與Raf-1激酶域相互作用,抑制Raf-1/MEK/ERK1,2信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。而RKIP的過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)HSCs的遷移。Locostatin是一種無(wú)抗菌活性的黃惡唑酮衍生物,是RKIP特異性抑制劑。本論文應(yīng)用四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl4)誘導(dǎo)小鼠肝纖維化形成,并通過(guò)腹腔注射Locostatin進(jìn)行干預(yù),旨在研究Locostatin對(duì)小鼠肝纖維化的影響及其作用機(jī)制。目的：CCl4誘導(dǎo)小鼠肝臟纖維化過(guò)程中,腹腔注射RKIP特異性抑制劑Locostatin進(jìn)行干預(yù),通過(guò)對(duì)肝臟炎癥及纖維化指標(biāo)的檢測(cè),研究Locostatin能否延緩肝纖維化的進(jìn)展,甚至預(yù)防、阻止肝纖維化形成。方法：將27只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組,模型組,治療組。治療組在CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型過(guò)程中,通過(guò)腹腔注射Locostatin進(jìn)行干預(yù)。通過(guò)檢測(cè)血清中谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate transaminase,AST)的水平及肝臟組織HE染色來(lái)研究肝臟炎癥程度的變化,通過(guò)血清羥脯氨酸(hydroxyproline, HYP)及肝臟組織Masson、苦味酸-天狼星紅染色研究膠原的變化。通過(guò)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription quantitative PCR, RT-qRCR)分析I型膠原、III型膠原、IV型膠原、MMP-13、MMP-2、 TIMP-1、TIMP-2、RKIP及α-SMA基因水平的表達(dá)。通過(guò)免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry, IHC)及western blot方法分析I型膠原、III型膠原、IV型膠原、α-SMA及RKIP蛋白的表達(dá)。運(yùn)用酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)測(cè)定MMP-13、MMP-2、TIMP-1及TIMP-2蛋白的表達(dá)量。結(jié)果：1 Locostatin可以抑制炎癥反應(yīng),減少HSCs活化及膠原沉積：在HE染色中模型組炎癥重于治療組,正常對(duì)照組無(wú)炎癥反應(yīng)。在Masson染色及苦味酸-天狼星紅染色中模型組膠原含量多于治療組,正常對(duì)照組未見(jiàn)膠原在異常部位的沉積。IHC中模型組I、III型膠原及α-SMA的表達(dá)多于治療組,正常對(duì)照組表達(dá)最少。IV型膠原在模型組表達(dá)量最低,治療組表達(dá)量最高。模型組ALT(189.43±64.25)水平明顯高于(P0.01)正常對(duì)照組(8.06±4.46)及治療組(61.88±5.40)水平,正常對(duì)照組與治療組無(wú)顯著性差異(P0.05)。模型組AST(231.15±39.86)水平明顯高于(P0.01)正常對(duì)照組(39.46±23.11)及治療組(84.61±29.36)水平,正常對(duì)照組與治療組無(wú)顯著性差異(P0.05)。模型組HYP(3.07±0.47)水平明顯高于(P0.01)正常對(duì)照組(1.63±0.78)及治療組(2.06±0.83)水平,正常對(duì)照組與治療組無(wú)顯著性差異(P0.05)。2 Locostatin可以降低I型膠原、III型膠原及α-SMA mRNA的表達(dá)量,增加IV型膠原及RKIP mRNA的表達(dá)量。2.1 Locostatin可以降低I型及III型膠原mRNA的表達(dá)量：治療組I型膠原mRNA的相對(duì)表達(dá)量(3.60±0.31)較模型組(9.51±1.37)顯著降低(P0.01)。治療組III型膠原mRNA的相對(duì)表達(dá)量(1.25±0.22)較模型組(3.23±0.43)顯著降低(P0.01)。2.2模型組中IV型膠原mRNA表達(dá)量減少,Locostatin可以增加IV型膠原mRNA表達(dá)量：模型組IV型膠原mRNA的相對(duì)表達(dá)量(0.71±0.21)較治療組(4.80±1.22)顯著降低(P0.01)。2.3模型組TIMP-1、MMP-13、TIMP-2、MMP-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量(0.84±0.14,0.91±0.02,0.45±0.05,0.73±0.25)較治療組(0.79±0.13,0.60±0.22,0.49±0.18,0.58±0.16)無(wú)明顯差異(P0.05)。2.4 Locostatin可以降低α-SMA mRNA表達(dá)量：模型組α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)量(6.73±0.10)較治療組(2.71±0.31)顯著升高(P0.01)。2.5 Locostatin可以增加RKIP mRNA的表達(dá)量：治療組RKIP mRNA的相對(duì)表達(dá)量(3.49±0.50)較模型組(1.06±0.16)顯著升高(P0.01)。3 Locostatin可以降低Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、α-SMA蛋白表達(dá)量,增加Ⅳ型膠原、RKIP蛋白表達(dá)量。3.1模型組中Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)升高,Locostatin可以降低Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)：治療組(0.68±0.06)較正常對(duì)照組(0.22±0.04)Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)量顯著增高(P0.01),治療組I型膠原蛋白表達(dá)量較模型組(1.37±0.13)明顯降低(P0.01)。3.2模型組中Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)升高,Locostatin可以降低Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)：治療組(0.16±0.02)較正常對(duì)照組(0.11±0.02)Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)量顯著增高(P0.01),治療組Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)量較模型組(0.26±0.07)明顯降低(P0.01)。3.3模型組中Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)量最低,而Locostatin可以增加Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)：模型組Ⅳ型膠原蛋白相對(duì)表達(dá)量(0.21±0.04)較正常對(duì)照組(0.38±0.07)及治療組(0.68±0.04)均顯著降低(P0.01),正常對(duì)照組蛋白相對(duì)表達(dá)量較治療組顯著降低(P0.01)。3.4模型組中α-SMA蛋白表達(dá)增加,Locostatin干預(yù)可以減少HSCs的活化,降低α-SMA蛋白的表達(dá)：模型組α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)量(1.54±0.13)比正常對(duì)照組(0.42±0.04)及治療組(0.63±0.06)顯著升高(P0.01),治療組α-SMA蛋白表達(dá)量比正常對(duì)照組明顯升高(P0.05)。3.5 CCl4造模不會(huì)影響RKIP的表達(dá),但Locostatin干預(yù)可以反應(yīng)性的引起RKIP表達(dá)量升高：治療組RKIP蛋白的相對(duì)表達(dá)量(0.82±0.12)較模型組(0.46±0.09)均顯著增高(P0.01),正常對(duì)照組(0.29±0.05)及模型組RKIP蛋白的相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯差異(P0.05)。4 Locostatin通過(guò)調(diào)節(jié)MMP-13及TIMP-1的比值,促進(jìn)Ⅰ型及Ⅲ型膠原降解。4.1 CCl4造模可以降低TIMP-1蛋白的表達(dá),Locostatin干預(yù)對(duì)TIMP-1蛋白含量影響不大：模型組(136.88±39.51)及治療組(140.39±24.70)TIMP-1的表達(dá)量比正常對(duì)照組(244.29±74.25)顯著降低(P0.05),模型組及治療組TIMP-1的表達(dá)無(wú)明顯差異(P0.05)。4.2.模型組中MMP-13蛋白的表達(dá)降低,Locostatin干預(yù)對(duì)MMP-13蛋白含量影響不大：模型組(23.04±4.05)及治療組(20.44±5.35)MMP-13的表達(dá)比正常對(duì)照組(31.96±8.28)明顯降低(P0.05),模型組及治療組MMP-13的表達(dá)無(wú)明顯差異(P0.05)。4.3模型組中TIMP-2蛋白的表達(dá)降低,Locostatin干預(yù)對(duì)TIMP-2蛋白含量影響不大：模型組(8.72±5.17)及治療組(9.42±3.01)TIMP-2的表達(dá)量比正常對(duì)照組(18.07±7.18)明顯降低(P0.05),模型組及治療組TIMP-2的表達(dá)無(wú)明顯差異(P0.05)。4.4模型組中MMP-2蛋白的表達(dá)降低,Locostatin干預(yù)對(duì)MMP-2蛋白含量影響不大：模型組(326.42±64.63)及治療組(342.54±66.73)MMP-2的表達(dá)量比正常對(duì)照組(700.99±245.48)顯著降低(P0.01),模型組及治療組MMP-2的表達(dá)無(wú)明顯差異(P0.05)。4.5 Locostatin可以促進(jìn)膠原降解：模型組(0.17±0.02)及治療組(0.19±0.01)MMP-13/TIMP-1比值較正常對(duì)照組(0.13±0.02)顯著升高(P0.01),模型組MMP-13/TIMP-1比值比治療組顯著降低(P0.01)。4.6正常對(duì)照組(0.40±0.07)、模型組(0.39±0.02)及治療組(0.43±0.03)三組MMP-2/TMP-2相比,無(wú)明顯差異(P0.05)。結(jié)論:Locostatin可以降低CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠的肝臟炎癥程度,這可能是通過(guò)Locostatin抑制炎癥細(xì)胞遷移實(shí)現(xiàn)的。其次,Locostatin通過(guò)抑制肝星狀細(xì)胞活化并增加MMP-13與TIMP-1比值,減少了Ⅰ型及Ⅲ型膠原沉積,延緩了肝纖維化進(jìn)展。
【關(guān)鍵詞】：Locostatin 肝纖維化 小鼠 肝星狀細(xì)胞 RKIP 基質(zhì)金屬蛋白酶 基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R575.2
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文縮寫(xiě)13-14
• 前言14-15
• 材料與方法15-30
• 結(jié)果30-36
• 附圖36-45
• 附表45-47
• 討論47-50
• 結(jié)論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-53
• 綜述 肝纖維化動(dòng)物模型的制備及藥物干預(yù)方式的選擇53-62
• 參考文獻(xiàn)58-62
• 致謝62-63
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷63

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  本文關(guān)鍵詞：Locostatin對(duì)肝纖維化小鼠肝臟膠原代謝的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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