目的應(yīng)用鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ（calmodulin kinase Ⅱ,Ca MK Ⅱ）抑制劑KN-62和三磷酸肌醇激動(dòng)劑尿苷三磷酸（uridine triphosphate,UTP）作用于人肝星狀細(xì)胞（Hepatic Stellate Cell,HSC）,觀察HSC凋亡情況,旨在從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑（Endoplasmic Reticulum Stress,ERS）探討Ca MK Ⅱ?qū)SC凋亡的作用機(jī)制,為尋找治療肝纖維化（Hepatic Fibrosis,HF）的新靶點(diǎn)提供科學(xué)依據(jù)。方法復(fù)蘇液氮罐中的HSC,把生長(zhǎng)良好的細(xì)胞均分為5組:空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β₁（Transforming growth factor beta-1,TGF-β₁）組、KN-62組、UTP組、KN-62+UTP組。空白對(duì)照組加無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,TGF-β₁組加入5 ng/m L TGF-β₁培養(yǎng)24 h,其他三組在5 ng/m L TGF-β₁培養(yǎng)24 h之后,棄去培養(yǎng)基,KN-62組更換10μ... 

【文章來源】：華北理工大學(xué)河北省

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

KN-62及UTP作用HSC后調(diào)控ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究圖

華北理工大學(xué)碩士學(xué)位論文-10-速冷凍離心機(jī)等。全程操作，均冰上進(jìn)行。2）吸取各孔上清，移入EP管后，以3000rpm/min10min條件離心，取上清，避免觸及底部顆粒和細(xì)胞碎片等。3）取出存放于4℃冰箱中的試劑盒置于常溫條件下，用鑷子夾取實(shí)驗(yàn)所需數(shù)量的酶標(biāo)板板條。4）據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，分為以下孔別：空白孔：樣品、酶標(biāo)試劑均不加，剩余操作相同；標(biāo)準(zhǔn)樣品孔：加50μL標(biāo)準(zhǔn)品；待測(cè)樣品孔：加40μL樣品稀釋液及10μL待測(cè)樣品。加樣操作需嚴(yán)謹(jǐn)，勿觸及孔壁，加于孔底，輕晃混勻。5）封板膜密封各孔，37℃恒溫條件，靜置30min。6）稀釋30x洗滌液至1x，備用。7）揭開封板膜，甩棄孔內(nèi)液體，移液器吸取200μL1x洗滌液加至各孔，30s后甩棄，洗滌5次。8）加酶標(biāo)試劑50μL于每孔（除空白孔），封板膜密封各孔，37℃恒溫條件，靜置30min。9）操作同7）。10）先后加入A、B顯色劑各50μL，晃勻，37℃恒溫條件下靜置30min。11）加終止液50μL，15min內(nèi)檢測(cè)。12）以空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)下，檢測(cè)OD值。圖2CaMKII標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程1.2.7TUNEL法觀察HSC凋亡1）取無菌玻片分別放于24孔板孔內(nèi)，各孔加入已終止消化的HSC懸液500μL，

華北理工大學(xué)碩士學(xué)位論文-14-1.2.11WesternBlot法檢測(cè)CaMKII、ERS蛋白GRP78、凋亡調(diào)控蛋白（Caspase-12、Caspase-3、Bcl-2及Bax）的表達(dá)1）提總細(xì)胞蛋白（1）4℃條件下預(yù)冷試劑、耗材及設(shè)備：PBS緩沖液、蛋白提取液、細(xì)胞刮、EP管、離心機(jī)等。全程操作，均冰上進(jìn)行。（2）取出6孔板，PBS清洗細(xì)胞3次，每次盡量吸凈底部殘余液體。（3）加蛋白提取液至6孔板，每孔200μL，靜置30min。（4）細(xì)胞刮朝同一方向刮下細(xì)胞，刮至板底透亮，刮凈培養(yǎng)瓶各底角。（5）槍頭吸取細(xì)胞，移入EP管中，標(biāo)記，以12000rpm/min15min條件離心。（6）收集上清液，勿觸及沉淀，移入新EP管并標(biāo)記，隨后保存于-80℃冰箱中。2）BCA法測(cè)定蛋白的濃度（1）混合適量1：50的A液和B液。（2）根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需量，PBS稀釋標(biāo)準(zhǔn)蛋白原液（25mg/mL），調(diào)整其工作液濃度為0.5mg/mL，避光保存，以備用。（3）取標(biāo)準(zhǔn)蛋白工作液0、1、2、4、8、12、16、20μL按序加至96孔板第1排，各組樣品設(shè)定3個(gè)復(fù)孔。（4）取PBS20、19、18、16、12、8、4、0μL按序加至上述3）含標(biāo)準(zhǔn)蛋白工作液的孔內(nèi)。（5）取待測(cè)蛋白2μL加至96孔板第4排，各組樣品設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，加18μLPBS于各待測(cè)蛋白孔。（6）加200μLBCA工作液于各孔，37℃條件下溫育30min。（7）562nm波長(zhǎng)下，測(cè)定OD值。（8）5x上樣緩沖液和蛋白樣品混合為1x濃度即止，以100℃5min條件加熱，隨后在-80℃條件下保存。圖3BCA標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Hepatic fibrosis:It is time to go with hepatic stellate cell-specific therapeutic targets[J]. Devaraj Ezhilarasan,Etienne Sokal,Mustapha Najimi.  Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 2018(03)
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