目的：構(gòu)建重組人ZAG（Zinc-α2glycoprotein）真核表達(dá)載體，并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，觀察HepG2細(xì)胞過表達(dá)ZAG后對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的甘油三酯沉積的影響。方法：提取HepG2細(xì)胞總RNA，通過RT-PCR方法擴(kuò)增出ZAG序列，克隆入經(jīng)XhoI和SacII雙酶切后的pIRES2-ZsGreen1，重組人ZAG真核表達(dá)質(zhì)粒（pIRES2-ZsGreen1-hZAG）通過核苷酸測序鑒定。使用不同濃度pIRES2-ZsGreen1-hZAG的經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞24小時(shí)，western-blotting鑒定ZAG陽性細(xì)胞，并采用棕櫚酸誘導(dǎo)該細(xì)胞脂肪變性，采用油紅O染色觀察各組細(xì)胞內(nèi)脂滴情況，酶聯(lián)免疫法檢測細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的水平。結(jié)果：1.成功構(gòu)建人ZAG基因的真核表達(dá)載體pIRES2-ZsGreen1-hZAG，該載體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，能顯著增加ZAG蛋白的表達(dá)。2.與對(duì)照組相比，過表達(dá)ZAG的HepG2細(xì)胞能減少棕櫚酸誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量；油紅O染色結(jié)果顯示過表達(dá)ZAG的HepG2細(xì)胞在棕櫚酸誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)橘紅色脂滴較對(duì)照組HepG2細(xì)胞明顯減少。結(jié)論：1.構(gòu)建了Z... 

【文章來源】：南華大學(xué)湖南省

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

pIRES2-ZsGreen1質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖

3.1 重組質(zhì)粒的 DNA 測序分析對(duì)重組質(zhì)粒pIRES2-ZsGreen1-hZAG進(jìn)行核苷酸序列測定，證實(shí)hZAG定向插入真核表達(dá)載體中（圖2）圖 2： 重組質(zhì)粒pIRES2-ZsGreen1-hZAG核苷酸序列分析部分序列圖3.2 pIRES2-ZsGreen1-hZAG瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞熒光表達(dá)情況使用 pIRES2-ZsGreen1–hZAG 重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 HepG2 細(xì)胞 12 小時(shí)，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情況，結(jié)果顯示視野下可見大量綠色熒光，表明pIRES2-ZsGreen1–hZAG 重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入 HepG2 細(xì)胞內(nèi)，并指導(dǎo) ZsGreen1 蛋白表達(dá)。

28圖3: 重組質(zhì)粒pIRES2-ZsGreen1-hZAG轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞熒光表達(dá)圖3.3 pIRES2-ZsGreen1-hZAG瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞的濃度篩選將濃度分別為 1.5μg/ml、2μg/ml、2.5μg/ml、3μg/ml pIRES2-ZsGreen1-hZAG瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 HepG2 細(xì)胞，用 Western-blotting 檢測 hZAG 表達(dá)情況。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染 3μg/ml 的 hZAG 質(zhì)粒組 ZAG 蛋白表達(dá)量最高，因此后續(xù)試驗(yàn)選擇濃度為3μg/ml 的 pIRES2-ZsGreen1-hZAG 轉(zhuǎn)染 HepG2 細(xì)胞。圖 4：不同濃度的 hZAG 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 HepG2 細(xì)胞 ZAG 蛋白的表達(dá)* p <0.05 與 Vector 組比較；** p <0.01 與 Vector 組比較。controlvector1.5μg/ml2μg/ml2.5μg/ml3μg/ml0

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Fatty Acid Synthase and Hormone-sensitive Lipase Expression in Liver Are Involved in Zinc-α2-glycoprotein-induced Body Fat Loss in Obese Mice[J]. Feng-ying Gong,Jie-ying Deng,Hui-juan Zhu,Hui Pan,Lin-jie Wang,and Hong-bo Yang Department of Endocrinology,Key Laboratory of Endocrinology of Ministry of Health,Peking Union Medical College Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College,Beijing 100730,China.  Chinese Medical Sciences Journal. 2010(03)
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本文編號(hào)：3270313