背景與目的建立C57BL/6小鼠乙型肝炎病毒HBV感染的動物模型,參考基因芯片結(jié)果,檢測模型肝組織中趨化因子IL-18、Mig、IP-10、CXCL12、CCR7、CCL19及部分急性期蛋白基因、免疫相關蛋白的基因表達差異,為進一步研究炎性因子在HBV感染中作用及其機制奠定基礎。實驗方法1.建立C57BL/6小鼠HBV感染的動物模型:pBluescript-HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)化超級感受態(tài)細菌DH5α,提取大量質(zhì)粒,高壓水動力法于小鼠尾靜脈注射,建立感染模型,同時設立空載對照組（pBluescript）動物模型。2.建模第4天取模型動物外周血,ELISA試劑盒檢測外周血中HBsAg的表達水平,驗證感染模型是否成功建立,收取肝組織凍存。3.參考基因芯片檢測結(jié)果,挑選感興趣的差異表達趨化因子,設計引物。Trizol法提取肝組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,Real-time PCR檢測實驗組和對照組對應因子的基因拷貝數(shù)量,RT-PCR凝膠電泳分析。4.免疫組織化學法對表達差異較明顯的因子IP-10進行檢測。結(jié)果1.HBV感染C57BL/6小鼠模型的建立:ELISA檢測尾靜脈高壓注射HBV C57BL... 

【文章來源】：華中科技大學湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

空載組和實驗室的比較分析散點圖

圖 2. ELISA 檢測 HBsAg 表達Negtive(-)：試劑盒內(nèi)陰性樣品，Positive(+)：試劑盒內(nèi)陽性樣本，norm未處理小鼠，pBluescript：pBluescript 注射小鼠模型，pBluescript-HBVpBluescript-HBV 注射小鼠模型。三、HBV 感染模型鼠趨化因子的表達1. Real-time PCR 結(jié)果Trizol 法提取組織中總 RNA，逆轉(zhuǎn)錄酶將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，在 96 孔板式 PCR 儀器上 58℃退火擴增基因，以各組的 β-actin 為內(nèi)參進行數(shù)據(jù)整理。3 結(jié)果可見溶解曲線顯示為單峰，圖 4 結(jié)果顯示擴增曲線的上升期在 15-30cy之間，表明實驗引物間無二聚體形成，實驗結(jié)果可靠，可以作為分析參考數(shù)據(jù)

圖 5 空載組（pBluescript）和實驗組（pBluescript-HBV）趨化因子的表. RT-PCR 結(jié)果為驗證 Real-time PCR 結(jié)果，設計針對差異表達明顯的 IL18，Mig， IPxcl12，Ccl19，Ccr7 引物，以 Trizol 法提取組織中的總 RNA 為模板，進一 RT-PCR 擴增目的基因，同時擴增 β-actin 基因。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖泳，結(jié)果如圖 6 所示，在泳道 1 和泳道 8 近 200bp 處可見擴增條帶，與-actin171bp 大小一致。在泳道 9-14 可見 300-400bp 擴增條帶，分別與引物增的 IL-18（395bp），Mig（487bp），IP-10（403bp），cxcl12（377bp），422bp），ccr7（380bp）大小相符，提示 HBV 感染模型組均有上述趨化因達，與定量 PCR 所測目的基因表達變化趨勢一致，而空載 pBluescript 組因子的表達，RT-PCR 結(jié)果亦表明 HBV 感染可誘導肝細胞表達 IL18，MP10，Cxcl12，Ccl19，Ccr7。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]Role of chemokines and their receptors in viral persistence and liver damage during chronic hepatitis C virus infection[J]. Juan R Larrubia,Selma Benito-Martínez,Miryam Calvino,Eduardo Sanz-de-Villalobos,Trinidad Parra-Cid.  World Journal of Gastroenterology. 2008(47)



本文編號：3217631