研究目的：建立HBV esiRNA文庫制備技術(shù)；研究該文庫對HepG2.215細(xì)胞內(nèi)HBV表面抗原（HBsAg）表達(dá)的抑制效應(yīng)。研究方法：1,GST-大腸桿菌核糖核酸內(nèi)切酶Ⅲ（GST-RNaseⅢ）融合蛋白的純化構(gòu)建RNaseⅢ重組載體pGEX-KG-RNaseⅢ.將由乳糖操縱子控制的GST-RNaseⅢ表達(dá)質(zhì)粒pGEX-KG-RNase;Ⅲ轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21（DE3）,挑取單克隆,大量培養(yǎng)并用乳糖類似物IPTG誘導(dǎo)該蛋白表達(dá)。收集大量培養(yǎng)的誘導(dǎo)菌株,裂解并應(yīng)用GST-瓊脂糖凝膠珠親和層析分離GST-RNaseⅢ.應(yīng)用透析法純化GST-RNaseⅢ2,HBV基因組序列1～540核苷酸（HBV-1）的雙向轉(zhuǎn)錄模板（T7-HBV-1）以及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物制備及鑒定設(shè)計針對HBV-1并的5’端均含有T7啟動子的引物,并通過PCR體外擴增得到T7-HBV-1 DNA。應(yīng)用T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄該模板,同時將轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)物退火,并鑒定產(chǎn)物為雙鏈RNA（dsRNA）,即T7-HBV-1 dsRNA。3, GST-RNaseⅢ酶活性檢測以及反應(yīng)條件的優(yōu)化和T7-HBV-1小干擾RNA（T7-HBV-1... 

【文章來源】：山東大學(xué)山東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：54 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

GST-RNaselH蛋白誘導(dǎo)及純化

indueedBL21(DE3)lysate;2，GST一RNaselllixlthesul)erzlatantofGST一be。。15elutedbyred、，eing9lu士at卜liollesolotioxl:3，GST一RNaselllafterdialysis:beads，GST一RNas。川z、emair:ix飛91一1theelotedbeads:l口g、2盡g、4“9BSAtoidel:tifytheGST一RNaseIJIeo，:ec:、，z士i，atiolz.3.3T7一HBVeslON^擴增與dsRN^產(chǎn)物分析及鑒定1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析體外擴增T7一HBV一1DNA產(chǎn)物以及純化得到目的片段大小在500一75Obp之I句，與理論大小(586bp)一致(圖ZA，B)。T7一HBV一1DNA體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)退火之后進(jìn)行產(chǎn)物鑒定:DNasel處理之后，產(chǎn)物條帶跟無處理組相比較沒有變化，說明產(chǎn)物不是DNA;DNasel與RNaseA處理后條帶亮度跟對照相似，說明產(chǎn)物不是單鏈RNA;產(chǎn)物加入RNaseA95℃水浴IOmin處理后，迅速冰浴以保持產(chǎn)物單鏈狀態(tài)和保證RNaseA的活性并處理lh，條帶有部分降解，說明產(chǎn)物可以解成單鏈的RNA而被RNaseA降解，所以最終產(chǎn)物是雙鏈RNA(命名為T7一HBV一1dSRNA)(圖ZC)。MT7一HBV一1

圖440fo低熔點瓊脂糖凝膠TBE電泳檢測T7一HBVesiRNAA:GST一RNase川酶活隊檢測以及反應(yīng)條件的優(yōu)化1.2p9GST一RNaselll于20pl酶反J位體系，37℃水浴中分別作用酶切丁71dSRNAI時間為0.5、1、1.5和Zh。B:純化的T7一HBV一1esiRNA及土〔’、siRNA)\小對比。Fig.4Eleeti、opho]一esisofIIB、eSIR入Alib工al，y011準(zhǔn)%low12一。1飛1119agal、osege]11飛TBEIJllffezlA:GST一RXaselllaetivitiesassayandoptimizationofl，eaetioneonditiol飛.Digestio一15werepel，foz一Inedusixlg1.2以9GST一RNaseT丁112120，1ofl、eaetiol〕solutiollat370Cfor0.5、1.0、1.5and2hours.B:Sizeeo一npai、isorlofPux，ifiedT7一I一IBV一1esiRXAwithehemiealsyllt}zesized5iRNA.3.5T7一HBVesles1RNA效應(yīng)檢測通過HBV基因組與HBV一1序列對比模式圖分析T7一I侶V--1esiRNA文庫在IIBV基因組的作用靶區(qū)，發(fā)現(xiàn)該文庫與11BSAg開放閱讀框架部分重疊(見圖4A)。所以

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Cost-effective method of siRNA preparation and its application to inhibit hepatitis B virus replication in HepG2 cells[J]. Zhi-Kang Qian, Bao-Qin Xuan, Tai-Shan Min, Jian-Feng Xu, Lin Li, Wei-Da Huang, Department of Biochemistry, School of Life Sciences, Fudan University, 220 Handan Road, Shanghai 200433, China.  World Journal of Gastroenterology. 2005(09)



本文編號：3208148