目的:HBV不能在體外培養(yǎng),其感染宿主范圍窄,動(dòng)物模型缺乏,制約了HBV研究方法的進(jìn)展。將攜帶HBV基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入靶細(xì)胞,建立表達(dá)HBV相關(guān)蛋白的體外細(xì)胞模型對(duì)研究HBV相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制及各基因產(chǎn)物的生物學(xué)功能有很大幫助。我們采用PCR方法分別擴(kuò)增HBV的四種抗原基因片段,通過中間載體pEASY-T1 Simple,構(gòu)建包含四種抗原基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)染肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞HepG2,同時(shí)轉(zhuǎn)染正常肝細(xì)胞LO2作為對(duì)照,監(jiān)測(cè)抗原的表達(dá),為研究各抗原的生物學(xué)功能及其與免疫細(xì)胞的相互作用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法:⒈包含HBV的各抗原基因片段的重組質(zhì)粒的構(gòu)建（1）采用PCR方法分別擴(kuò)增HBV的各抗原基因片段（2）通過中間載體pEASY-T1 Simple,構(gòu)建分別包含四種抗原HBsAg,HBeAg,HBcAg,HBeAg（P22）基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒。（3）重組質(zhì)粒的雙酶切,DNA測(cè)序鑒定。2、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的建立:（1）轉(zhuǎn)染方法:采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將各重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞HepG2,同時(shí)轉(zhuǎn)染正常肝細(xì)胞LO2作為對(duì)照,建立表達(dá)HBV抗原基因的體外真核細(xì)胞模型。根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的不同,將... 

【文章來(lái)源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

【文章頁(yè)數(shù)】：51 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

PCR擴(kuò)增HBV各抗原基因片段Figure1-1PCRamplificationofHBVantigengenesLane1:DNAMarkerDL2000；

CMV-tag2B-HBsAg，pCMV-tag2B-HBeAg，pCMV-tag2B- HBcAg- HBeAg(P22)真核表達(dá)載體的構(gòu)建粒 pcDNA3.1-HBV 為模板，用相應(yīng)的上下游引物配對(duì)分別擴(kuò)增出 549bp，581bp 大小的 HBsAg，HBeAg,HBcAg, HBeAg(P22)基因片段）。對(duì)應(yīng) PCR 產(chǎn)物和 T 載體 pEASY-T1 Simple 連接后中間克隆載體雙酶切鑒定，片段大小與預(yù)期相符（圖 1-3,圖 1-4）。酶切正確后回收，與經(jīng)相同酶切線性化的載體 pCMV-tag2B 分別經(jīng) T4 DNA 連接化 JM109 大 腸 桿 菌 ， 從 而 得 到 重 組 質(zhì) 粒 pCMV-tag2B--tag2B-HBeAg，pCMV-tag2B-HBcAg，pCMV-tag2B-HBeAg(P22)。重組定結(jié)果表明片段大小與預(yù)期相符（圖 1－5，圖 1-6）。在 GenBan的 DNA 序列測(cè)定結(jié)果進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明 HBsAg，HBeAg，g(P22)的基因和蛋白序列與基因序列號(hào)為 U 95551 的 HBV 克隆質(zhì)粒完

26圖1-3 中間克隆載體雙酶切鑒定Fig1-3 Identifaction of recombinant plasmidsby enzyme digestionLane 1：DNA Marker DL2000；Lane 2：pEASY-T1 Simple-HBs；Lane 3：pEASY-T1 Simple-HBeAg gene；Lane 4：pEASY-T1 Simple-HBcAg圖1-4 中間克隆載體雙酶切鑒定Fig1-4 Identifaction of recombinant plasmidsby enzyme digestionLane 1： DNA Marker Ⅲ;Lane 2：pEASY-T1 Simple-HBeAg(P22)圖1-5 重組真核表達(dá)質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig1-5 Identifaction of recombinant eukaryoticexpression plasmids by enzyme digestionLane1: DNA Marker DL2000；Lane2:pCMV-tag2B-HBs；Lane3:pCMV-tag2B-HBe；Lane4:pCMV-tag2B-HBc；Lane5: pCMV-tag2B vector；Lane6: λ-EcoT14 I digest DNA Marker圖1-6 重組真核表達(dá)質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig1-6 Identifaction of recombinanteukaryotic expression plasmids byenzyme digestionLane1: DNA Marker Ⅲ;Lane2:pCMV-tag2B-HBeAg(P22)2.2 脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率的鑒定取 pCMV-tag2B-HBsAg，pCMV-tag2B-HBeAg，pCMV-tag2B-HBcAg，pCMV-tag2B-HBeAg(P22)分別與 pEGFP-C1 共轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株 HepG2，于轉(zhuǎn)染后 24，48,72h 分別觀察 pEGFP-C1 細(xì)胞中 GFP 的表達(dá)。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，HepG2 細(xì)胞均有 GFP 的大量表達(dá)，且熒光表達(dá)較強(qiáng)，說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功（圖 1-7）。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Recognition of HBV antigens and HBV DNA by dendritic cells[J]. Guang-Ying Cui and Hong-Yan Diao State Key Laboratory for Diagnosis and Treatment of Infectious Disease,First Affiliated Hospital,Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou 310003,China.  Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 2010(06)
[2]The Immune Response Induced by Hepatitis B Virus Principal Antigens[J]. Chien-Fu Huang,Shih-Shen Lin,Yung-Chyuan Ho.  Cellular & Molecular Immunology. 2006(02)



本文編號(hào)：3141869