目的探討脂筏在內(nèi)源性大麻素受體2（CB2）介導(dǎo)的內(nèi)源性大麻素（AEA）抑制大鼠肝星狀細(xì)胞（HSC）增殖活性中的作用及作用機(jī)制。方法構(gòu)建大麻素受體2shRNA（Cnr2-shRNA）轉(zhuǎn)染HSC細(xì)胞,干擾CB2受體的表達(dá),采用MTT法檢測轉(zhuǎn)染前后不同濃度的AEA和甲基-β-環(huán)糊精（MCD）對HSC的作用效應(yīng);采用Western blot檢測不同濃度AEA及MCD作用后HSC中P38絲裂原活化蛋白激酶（p-P38MAPK）和c-Jun氨基端激酶/應(yīng)激活化蛋白激酶（p-JNK）的表達(dá)量;采用激光共聚焦法檢測HSC上的脂筏（LRs）以及CB2受體的表達(dá);蔗糖密度梯度離心法提取脂筏,Westernblot鑒定脂筏并檢測脂筏中CB2受體的表達(dá)。結(jié)果成功構(gòu)建Cnr2-shRNA轉(zhuǎn)染篩選Cnr2-單克隆細(xì)胞株,MTT檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后CB2受體的減少能減弱AEA對HSC細(xì)胞增殖的抑制作用,然而用MCD預(yù)處理HSC細(xì)胞后CB2受體的減少對AEA的效應(yīng)無明顯影響。p-P38MAPK和p-JNK的表達(dá)與AEA濃度有依賴關(guān)系,且可以被MCD部分拮抗。CB2受體在HSC膜脂筏和胞質(zhì)中均有表達(dá),但用蔗糖密度梯度離心法提... 

【文章來源】：華中科技大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版). 2012,41(02)北大核心CSCD

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圖１熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染前后ＨＳＣ（×５０）

ｐＧｅｎｅｓｉｌ－３－Ｃｎｒ２－ｓｈＲＮＡ圖１熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染前后ＨＳＣ（×５０）Ｆｉｇ．１ＯｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆＨＳＣｕｎｄｅｒｔｈｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ（×５０）１：Ｕｎｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｃｅｌｌｓ；２：ＣｅｌｌｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｅｍｐｔｙｐｌａｓｍｉｄｓｐＧｅｎｅｓｉｌ－３；３：ＣｅｌｌｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｐＧｅｎｅｓｉｌ－３－Ｃｎｒ２－ｓｈＲＮＡ圖２Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后ＣＢ２受體的表達(dá)Ｆｉｇ．２ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣＢ２ｉｎＨＳＣｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ２．２脂筏在ＡＥＡ通過ＣＢ２受體抑制ＨＳＣ細(xì)胞增殖中的作用ＭＴＴ法檢測ＭＣＤ去除脂筏前后不同濃度的ＡＥＡ對ＨＳＣ增殖的影響，發(fā)現(xiàn)ＭＣＤ本身對ＨＳＣ細(xì)胞增殖無影響，卻抑制了ＡＥＡ對ＨＳＣ細(xì)胞的增殖抑制作用（ＭＣＤ１０ｍｍｏｌ／Ｌ＋ＡＥＡ２０μｍｏｌ／Ｌ組ｖｓ．ＡＥＡ２０μｍｏｌ／Ｌ組以及ＭＣＤ１０ｍｍｏｌ／Ｌ＋ＡＥＡ１０μｍｏｌ／Ｌｖｓ．ＡＥＡ１０μｍｏｌ／Ｌ組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義）（表１），提示脂筏介導(dǎo)了ＡＥＡ對ＨＳＣ增殖的影響。然而，轉(zhuǎn)染ｐＧｅｎｅｓｉｌ－３－Ｃｎｒ２－ｓｈＲＮＡ后，ＡＥＡ２０μｍｏｌ／Ｌ處理組ＭＣＤ處理前后ＡＥＡ的抑制效應(yīng)無明顯差異，提示ＣＢ２受體減少后，ＭＣＤ對ＡＥＡ的抑制增殖效應(yīng)的影響明顯減弱（轉(zhuǎn)染ｐＧｅｎｅｓｉｌ－３－Ｃｎｒ２－ｓｈＲＮＡ組ＡＥＡ２０μｍｏｌ／Ｌ組ｖｓ．ＭＣＤ１０ｍｍｏｌ／Ｌ＋ＡＥＡ２０

０１］。ＭＣＤ可以部分抑制它們的激活［ｐ－Ｐ３８ＭＡＰＫ／β－ａｃｔｉｎ：ＡＥＡ２０μｍｏｌ／Ｌ＋ＭＣＤ１０ｍｍｏｌ／Ｌ（１．１４±０．０１）ｖｓ．ＡＥＡ２０μｍｏｌ／Ｌ（１．６３±０．０６），ｔ＝１２．９，Ｐ＝０．００５；ｐ－ＪＮＫ／β－ａｃｔｉｎ：ＡＥＡ２０μｍｏｌ／Ｌ＋ＭＣＤ１０ｍｍｏｌ／Ｌ（１．１０±０．１９）ｖｓ．ＡＥＡ２０μｍｏｌ／Ｌ（１．６７±０．２１），ｔ＝３．５，Ｐ＝０．０２５］（圖３）。１：ＡＥＡ５μｍｏｌ／Ｌｇｒｏｕｐ；２：ＡＥＡ１０μｍｏｌ／Ｌｇｒｏｕｐ；３：ＡＥＡ２０μｍｏｌ／Ｌｇｒｏｕｐ；４：ＡＥＡ２０μｍｏｌ／Ｌ＋ＭＣＤ１０ｍｍｏｌ／Ｌｇｒｏｕｐ圖３Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ檢測不同濃度的ＡＥＡ和ＭＣＤ處理后ｐ－Ｐ３８ＭＡＰＫ和ｐ－ＪＮＫ活性Ｆｉｇ．３Ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｐ－Ｐ３８ＭＡＰＫａｎｄｐ－ＪＮＫｉｎＨＳＣｐｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｖａｒｉｏｕｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＡＥＡａｎｄＭＣＤ２．４脂筏和ＣＢ２受體在ＨＳＣ細(xì)胞中的定位將細(xì)胞分別予以ＡＥＡ０μｍｏｌ／Ｌ、ＭＣＤ１０ｍｍｏｌ／Ｌ和ＡＥＡ１０μｍｏｌ／Ｌ處理后，激光共聚焦法檢測脂筏和ＣＢ２受體在細(xì)胞中的亞定位。如圖４Ａ２、４Ｃ３，綠色熒光蛋白（Ａｌｅｘａ４８８－ＣＴＸ）代表脂筏，提示了ＨＳＣ細(xì)胞中脂筏的聚集，膽固醇膜耗竭劑ＭＣＤ處理后，細(xì)胞膜上綠色熒光蛋白明顯減少（圖４Ｂ２、４Ｃ２）。如圖４Ｃ４所示，紅色熒光代表ＣＢ２受體，它既存在于脂筏中，也存在


本文編號：3131011