現(xiàn)有的抗病毒藥物比如核苷類似物（nucleotide analogues,NAs）、聚乙二醇化的干擾素α（PEGylated interferon alpha,PEG-IFNα）等可以有效抑制乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）的復(fù)制,但是難以清除肝細(xì)胞內(nèi)的HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）。殘余的cccDNA容易導(dǎo)致停藥后慢性乙型病毒性肝炎（Chronic hepatitis B,CHB）的復(fù)發(fā)甚至進(jìn)展。因此肝內(nèi)cccDNA的水平是判斷乙肝是否被治愈的重要參考指標(biāo)。然而直接肝臟穿刺活檢檢測(cè)肝內(nèi)cccDNA的水平屬于有創(chuàng)檢查,無法作為常規(guī)臨床檢查手段,需要尋找無創(chuàng)的替代手段,比如血清學(xué)檢查反映肝內(nèi)cccDNA的水平等。乙型肝炎病毒cccDNA可以生成0.7kb、2.1kb、2.4kb、3.5kb等多種不同長度的轉(zhuǎn)錄本,其中3.5kb的前基因組RNA（pregenomic RNA,pgRNA）是唯一能夠反轉(zhuǎn)錄生成松弛環(huán)狀DNA（relaxed circular DNA,rc DNA）負(fù)鏈的轉(zhuǎn)錄本。r... 

【文章來源】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)上海市 211工程院校

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

HBV基因組、不同轉(zhuǎn)錄本及引物探針設(shè)計(jì)位點(diǎn)示意圖

用探針法雙重定量PCR同時(shí)檢測(cè)乙型肝炎病毒前基因組RNA和DNA-17-圖1.2在不同退火溫度下，普通PCR/雙重PCR產(chǎn)物的DNA凝膠電泳圖A:以hepG2.2.15的cDNA為模板,在53-60℃等不同退火溫度下PCR產(chǎn)物的DNA凝膠電泳圖.seqA條帶大小118bp,seqB條帶大小173bp.Conventional:conventionalPCR,普通PCR;Duplex:duplexPCR,雙重PCR;M:Marker;AT:annealingtemperature,退火溫度.下同.B:分別以hepG2.2.15/hepG2/SMMC-7721的cDNA為模板,在60/62/64/66℃等不同退火溫度下,雙重PCR產(chǎn)物的DNA凝膠電泳圖.C:在60℃退火溫度下,以hepG2.2.15的cDNA為模板,分別進(jìn)行擴(kuò)增seqA的普通PCR,擴(kuò)增seqB的普通PCR和擴(kuò)增seqA/B的雙重PCR,上述PCR產(chǎn)物的DNA凝膠電泳圖.（二）生成qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線按照實(shí)驗(yàn)方法所述循環(huán)參數(shù)進(jìn)行qPCR，檢測(cè)2.3×107~2.3×103拷貝/μL等5個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值（每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品3復(fù)孔），設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)為x，以logx為X軸、Ct值為Y軸作標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1.3），seqA標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=-3.3517x+37.329，擴(kuò)增效率99%，相關(guān)系數(shù)R2=0.9976（圖1.3實(shí)線）；seqB標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=-3.443x+37.341，擴(kuò)增效率95%，R2=0.9966（圖1.3虛線）。同時(shí)seqA和seqB線性范圍可低至2.3×102拷貝/μL。用雙重PCR體系檢測(cè)1μghepG2RNA用OligodT18作為引物的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，seqA、seqB的檢測(cè)值均低于10拷貝/μL或未檢出（結(jié)果未顯示）。以上結(jié)果表明該雙重PCR檢測(cè)體系具有較好的靈敏度和特異性。圖1.3雙重PCR體系的標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)線:seqA標(biāo)準(zhǔn)曲線;虛線:seqB標(biāo)準(zhǔn)曲線.BC

用探針法雙重定量PCR同時(shí)檢測(cè)乙型肝炎病毒前基因組RNA和DNA-17-圖1.2在不同退火溫度下，普通PCR/雙重PCR產(chǎn)物的DNA凝膠電泳圖A:以hepG2.2.15的cDNA為模板,在53-60℃等不同退火溫度下PCR產(chǎn)物的DNA凝膠電泳圖.seqA條帶大小118bp,seqB條帶大小173bp.Conventional:conventionalPCR,普通PCR;Duplex:duplexPCR,雙重PCR;M:Marker;AT:annealingtemperature,退火溫度.下同.B:分別以hepG2.2.15/hepG2/SMMC-7721的cDNA為模板,在60/62/64/66℃等不同退火溫度下,雙重PCR產(chǎn)物的DNA凝膠電泳圖.C:在60℃退火溫度下,以hepG2.2.15的cDNA為模板,分別進(jìn)行擴(kuò)增seqA的普通PCR,擴(kuò)增seqB的普通PCR和擴(kuò)增seqA/B的雙重PCR,上述PCR產(chǎn)物的DNA凝膠電泳圖.（二）生成qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線按照實(shí)驗(yàn)方法所述循環(huán)參數(shù)進(jìn)行qPCR，檢測(cè)2.3×107~2.3×103拷貝/μL等5個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值（每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品3復(fù)孔），設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)為x，以logx為X軸、Ct值為Y軸作標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1.3），seqA標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=-3.3517x+37.329，擴(kuò)增效率99%，相關(guān)系數(shù)R2=0.9976（圖1.3實(shí)線）；seqB標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=-3.443x+37.341，擴(kuò)增效率95%，R2=0.9966（圖1.3虛線）。同時(shí)seqA和seqB線性范圍可低至2.3×102拷貝/μL。用雙重PCR體系檢測(cè)1μghepG2RNA用OligodT18作為引物的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，seqA、seqB的檢測(cè)值均低于10拷貝/μL或未檢出（結(jié)果未顯示）。以上結(jié)果表明該雙重PCR檢測(cè)體系具有較好的靈敏度和特異性。圖1.3雙重PCR體系的標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)線:seqA標(biāo)準(zhǔn)曲線;虛線:seqB標(biāo)準(zhǔn)曲線.BC

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]慢性乙型肝炎抗病毒治療相關(guān)新型標(biāo)志物及其臨床應(yīng)用[J]. 魯鳳民,曾婉嘉,文夏杰,廖昊,鄒軍,王雷婕,席婧媛,王建文,王杰,陳香梅.  肝臟. 2019(05)
[2]慢性乙型肝炎患者血清HBV RNA檢測(cè)的臨床意義[J]. 魯鳳民,竇曉光,張文宏,王福生.  臨床肝膽病雜志. 2018(05)
[3]Update on occult hepatitis B virus infection[J]. Manoochehr Makvandi.  World Journal of Gastroenterology. 2016(39)
[4]Effect of oxymatrine on the replication cycle of hepatitis B virus in vitro[J]. Wen-Sheng Xu,Xiao-Hui Miao,Wu Ni,Xiong Cai,Rui-Qi Zhang,Jun-Xue Wang,Department of Infectious Diseases,Changzheng Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200003,China Ke-Kai Zhao,Department of Infectious Diseases,No.404 Hospital,Weihai 264200,Shandong Province,China.  World Journal of Gastroenterology. 2010(16)



本文編號(hào)：3125845