TGF-β1是一個多效性生長因子，在調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)（ECM）的生成和器官、組織纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。肝星狀細胞（HSCs）是肝內(nèi)產(chǎn)生ECM的主要細胞，它的激活與活化狀態(tài)的維持是肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展過程中的重要事件之一，而HSCs的活化和生成ECM是由TGF-β1／Smad3信號通路調(diào)控的。大量研究表明，在不同位點、用不同的阻斷劑如抗體、競爭性Ⅱ型TGF-β受體、Ⅰ型TGF-β受體（TβR-Ⅰ）的小分子抑制劑、寡義核苷酸或小干擾RNA（siRNA）等阻斷TGF-β1／Smad3通路后，體內(nèi)外均能抑制ECM的過渡生成，并能減輕器官纖維化的程度，但以Smad3蛋白為靶點拮抗TGF-β1／Smad3通路的研究尚無報道。我們首先建立了TGF-β1／Smad3信號通路的蟲熒光素酶的報告基因系統(tǒng)，通過TβR-Ⅰ的小分子抑制劑—SB-431542的抑制實驗已確認此模型的有效性，并篩選了穩(wěn)定表達的MvLu1細胞株。通過柚皮素抑制TGF-β1／Smad3的報告基因系統(tǒng)實驗，我們首先證明柚皮素是TGF-β1／Smad3通路的拮抗劑；體外實驗表明，柚皮素不僅可以抑制TGF-β1誘導的HSCs生... 

【文章來源】：沈陽藥科大學遼寧省

【文章頁數(shù)】：118 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
第一章 緒論
    1 TGF-β1／Smad3信號傳導途徑
        1.1 TGF-βs超家族成員與其體內(nèi)表達及對生物活性的調(diào)控
        1.2 Ⅰ型和Ⅱ型TGF-β受體的結(jié)構(gòu)與功能
        1.3 TGF-β超家族誘導的細胞內(nèi)信號傳導
        1.4 Smads蛋白的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄活性
        1.5 與Smads蛋白結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子
        1.6 Ⅰ-Smads蛋白的功能
        1.7 TGF-β不依賴于Smads蛋白的信號轉(zhuǎn)導通路
        1.8 TGF-β／Smad3通路與其它信號轉(zhuǎn)導通路的交聯(lián)
    2 肝纖維化發(fā)病的分子機制
        2.1 細胞外基質(zhì)的主要成分及其功能特征
        2.2 肝纖維化的細胞內(nèi)組分與ECM之間的相互作用
        2.3 纖維化與肝星狀細胞
    3 肝纖維化的流行病學及治療方法
        3.1 流行病學現(xiàn)狀
        3.2 治療方法
    4 RNA干擾
    5 拮抗TGF-β1／Smad3信號通路對肝纖維化的防治作用
        5.1 在纖維化生成與發(fā)展過程中TGF-β1維持高水平
        5.2 外源性TGF-β1可導致ECM過多積累和纖維化發(fā)生
        5.3 在不同位點阻斷TGF-β1／Smad3信號通路都能防治肝纖維化
    6 立題依據(jù)
第二章 TGF-β／Smad3信號通路報告基因的建立與穩(wěn)定細胞克隆的篩選
    1 材料與試劑
    2 方法與步驟
    3 實驗結(jié)果
12-pMLP-Luc報告基因的構(gòu)建">        3.1 B4-（CAGA）₁₂-pMLP-Luc報告基因的構(gòu)建
        3.2 蟲熒光素酶活性測定
    4 討論
第三章 SB-431542和柚皮素對報告基因的阻斷作用
    1 材料與試劑
    2 方法與步驟
    3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計方法
    4 實驗結(jié)果
        4.1 SB-431542對雙報告基因系統(tǒng)的作用結(jié)果
        4.2 柚皮素對雙報告基因系統(tǒng)的作用結(jié)果
    5 討論
第四章 Naringenin對TGF-β1／Smad3信號通路的拮抗及對HSC產(chǎn)生ECM的抑制作用
    1 材料與試劑
    2 方法與步驟
    3 統(tǒng)計分析
    4 實驗結(jié)果
        4.1 柚皮素對HSCs的細胞毒較低
        4.2 柚皮素抑制Smad3的轉(zhuǎn)錄及其蛋白表達,而不影響TβR-Ⅰ和TβR-Ⅱ
        4.3 柚皮素不影響Smad2、Smad4和Smad7的轉(zhuǎn)錄
        4.4 柚皮素可在mRNA和蛋白水平同時抑制ECM的表達
    5 討論
第五章 干擾Smad3的siRNA的設計、連接載體及其活性篩選
    1 材料與試劑
    2 方法與步驟
    3 實驗結(jié)果
        3.1 表達S2-siRNA的寡核苷酸雙鏈與載體的連接
        3.2 表達S2質(zhì)粒的篩選
        3.3 S2-vector在HSCs內(nèi)的表達
        3.4 裸S2-siRNA對報告基因系統(tǒng)的作用結(jié)果
        3.5 S2-vector對報告基因系統(tǒng)的作用結(jié)果
    4 討論
第六章 SB-431542和siRNA／Smad3對HSC產(chǎn)生細胞外基質(zhì)的影響
    1 材料與試劑
    2 方法與步驟
    3 實驗結(jié)果
        3.1 SB-431542對TGF-β1誘導的HSCs生成Col Ia1、FN和PAI-1 mRNA的抑制作用
        3.2 siRNA／Smad3對TGF-β1誘導的HSCs生成Col Ia1、FN和PAI-1 mRNA的抑制
        3.3 siRNA／Smad3對TGF-β1誘導的HSCs生成Smad3、P-Smad3、Col Ia1、FN和PAI-1的抑制
    4 討論
第七章 siRNA／Smad3沉默Smad3基因防治DMN誘導的大鼠肝纖維化的作用研究
    1 材料與試劑
    2 方法與步驟
    3 統(tǒng)計軟件及方法
    4 實驗結(jié)果
        4.1 肝內(nèi)紅色熒光蛋白的表達
        4.2 動物存活率的差異
        4.3 肝臟外觀上的差異
        4.4 肝內(nèi)結(jié)構(gòu)的變化和組織學評分
        4.5 動物體重和肝臟重量的變化、肝內(nèi)ECM的變化
        4.6 血清內(nèi)TGF-β1水平的變化
        4.7 肝功能血清學各項指標的檢測結(jié)果
        4.8 血清內(nèi)ECM的變化
        4.9 肝內(nèi)Smad3和a-SMA表達量的變化
    5 討論
結(jié)論
參考文獻
縮略語
發(fā)表文章目錄
致謝
個人簡歷



本文編號：2945881