目的通過(guò)比較分析不同硬度基底上的融合生長(zhǎng)肝細(xì)胞（L02）的差異，探查細(xì)胞間粘附復(fù)合物穩(wěn)定性不同的成因，加深微觀力學(xué)環(huán)境改變對(duì)細(xì)胞群體生長(zhǎng)行為及其表型影響的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。方法構(gòu)建細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，制備聚乙烯醇水凝膠基底膜，硬度分別為3.6kPa、10kPa、30kPa。分別對(duì)應(yīng)正常的肝組織、纖維化中期的肝組織和纖維化末期的肝組織的硬度。運(yùn)用實(shí)時(shí)顯微拍攝觀察在不同硬度基底上L02細(xì)胞的形態(tài)特征；應(yīng)用免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)不同硬度基底上的細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架構(gòu)象、β-連環(huán)蛋白和vinculin表達(dá)分布；采用Western Blotting方法檢測(cè)不同硬度基底的細(xì)胞膜上β-連環(huán)蛋白的表達(dá)及細(xì)胞質(zhì)中vinculin的表達(dá)和β-連環(huán)蛋白的磷酸化水平。結(jié)果基底硬度對(duì)L02細(xì)胞的生物學(xué)行為具有重要影響。（1）融合生長(zhǎng)的L02細(xì)胞呈圓形或多邊形，隨基底硬度增加，L02細(xì)胞的球形指數(shù)增大。（2）采用EDTA處理匯合生長(zhǎng)的L02細(xì)胞，細(xì)胞逐漸分離，形態(tài)學(xué)表現(xiàn)現(xiàn)為細(xì)胞逐漸變圓，鋪展面積和細(xì)胞周長(zhǎng)逐漸縮小。隨著硬度增大，L02細(xì)胞從融合狀態(tài)到細(xì)胞-細(xì)胞間連接被破壞所需的時(shí)間依次變短。（3）融合生長(zhǎng)的L02細(xì)胞在軟基質(zhì)上... 

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細(xì)胞連接類(lèi)型Fig1.1Typeofcellconnection

圖 1.2 粘附連接復(fù)合物結(jié)構(gòu)Fig1.2 Diagram of adhesion complexes structure.1.2 細(xì)胞-細(xì)胞間粘附系統(tǒng)的功能粘附連接復(fù)合物對(duì)維持相鄰細(xì)胞間的粘著接觸以及調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白骨架，以上皮細(xì)胞的正常作用有重要作用。粘附連接復(fù)合物最重要的作用是它們有助于維持組織的完整性[13]。即加強(qiáng)中細(xì)胞-細(xì)胞間的內(nèi)聚力，這個(gè)作用在早期的胚胎發(fā)育中最重要。用突變體的素轉(zhuǎn)染到早期非洲爪蟾蜍胚胎中，導(dǎo)致了其組織完整性喪失，包括了胚胎外的不連續(xù)性和胚葉細(xì)胞的相互分離。而觀察到胚葉細(xì)胞的大量分離就證明了間粘附減弱。大量關(guān)于粘附連接復(fù)合物不穩(wěn)定的類(lèi)似研究表明，它們與細(xì)胞粘附強(qiáng)度以及細(xì)胞間粘附連接的穩(wěn)定性有密切關(guān)系。粘附連接復(fù)合物的第二功能是參與細(xì)胞分選和細(xì)胞間的識(shí)別。發(fā)育的基本是細(xì)胞有能力從與其不同的細(xì)胞中分離出來(lái)。通過(guò) Townes 和 Holtfreter 的實(shí)驗(yàn)可證明，來(lái)自分離的原腸胚階段的細(xì)胞能重組，這些細(xì)胞能夠重新排列

不同位點(diǎn)(絲氨酸或者蘇氨酸)能在酪氨酸激酶作用下被磷酸化，從而改變了β-連環(huán)蛋白與E-鈣粘素和α-連環(huán)蛋白的相互作用。β-連環(huán)蛋白有三個(gè)保守的酪氨酸殘基142，489和654如圖1.3，它們靠近鈣粘素并且調(diào)節(jié)粘附連接復(fù)合物的完整性[22]。酪氨酸142是β-連環(huán)蛋白與α-連環(huán)蛋白連接位點(diǎn)上的殘基。這個(gè)殘基的磷酸化作用使α-連環(huán)蛋白與β-連環(huán)蛋白分離，最終導(dǎo)致粘附復(fù)合物的喪失，因此對(duì)調(diào)節(jié)粘附連接起著重要作用[23]。酪氨酸142是Fyn、活化的Fer和c-Met的靶向目標(biāo)。酪氨酸489在Arm重復(fù)區(qū)N端的第2個(gè)螺旋處，通過(guò)Abl是其磷酸化導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白從E-鈣粘素上脫離。其中β-連環(huán)蛋白酪氨酸殘基654(Tyr654)與E-鈣粘素和β-連環(huán)蛋白親和性有密切關(guān)系[24-25]。酪氨酸654在Arm重復(fù)區(qū)的第3個(gè)螺旋處，這個(gè)殘基在β-連環(huán)蛋白中是保守的。一旦這一位點(diǎn)發(fā)生磷酸化（通過(guò)EGFR或者Src），β-連環(huán)蛋白將和E-鈣粘素解離，導(dǎo)致整個(gè)胞連接喪失功能。圖1.3 β-連環(huán)蛋白的磷酸化位點(diǎn)Fig1.3 Phosphorylation sites of β-catenin此外，大量證據(jù)說(shuō)明肌動(dòng)蛋白骨架對(duì)粘附復(fù)合物的穩(wěn)定性起著關(guān)鍵性作用。通過(guò)觀察看到肌動(dòng)蛋白骨架在細(xì)胞間連接處與細(xì)胞間粘附復(fù)合物共定位[26-27]。細(xì)胞間粘附連接復(fù)合物位于細(xì)胞表面

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]基底硬度與細(xì)胞因子TGF-β1協(xié)同作用對(duì)肝細(xì)胞表型的影響[J]. 王紅兵,徐以娟,徐秋華,于光磊,鄒小兵,楊力,白潔,楊雨,張持.  醫(yī)用生物力學(xué). 2012(06)
[2]基底硬度對(duì)肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞融合生長(zhǎng)的影響[J]. 張榮,王紅兵,楊本艷姿,譚喬燕,楊力.  醫(yī)用生物力學(xué). 2013(01)
[3]基底硬度和表面形貌對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[J]. 王紅兵,林雨,楊力,鄒小兵,吳澤志.  細(xì)胞生物學(xué)雜志. 2009(05)
[4]β連環(huán)蛋白與肝癌[J]. 鄧輝洲.  肝膽外科雜志. 2004(01)
[5]整合素及其與氣道高反應(yīng)的關(guān)系[J]. 向陽(yáng),秦曉群.  國(guó)外醫(yī)學(xué)(生理、病理科學(xué)與臨床分冊(cè)). 2003(02)
[6]整合素在細(xì)胞響應(yīng)機(jī)械應(yīng)力中的作用[J]. 張惠靜,蔡紹皙,盧曉.  生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展. 2002(03)



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