發(fā)布時(shí)間：2020-12-13 12:15

　　由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）和丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）等人嗜肝病毒感染所導(dǎo)致的急、慢性病毒性肝炎,以及由此發(fā)展成的肝硬化和肝癌是嚴(yán)重危害人類健康的重大傳染性疾病。目前全球至少有3.6億HBV慢性感染者和1.7億HCV感染者,每年由于HBV和HCV感染導(dǎo)致死亡的人數(shù)達(dá)1500萬。過去的十多年間,雖然在預(yù)防和治療急、慢性病毒性肝炎方面取得了一定進(jìn)展,但也帶來了許多問題,其中比較突出的是缺乏特效治療藥物以及耐藥性病毒株的出現(xiàn),而制約這一工作進(jìn)程的難題之一是沒有適用于藥物篩選的肝炎病毒體外感染細(xì)胞模型和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物評價(jià)模型。用肝炎病毒陽性血清直接感染原代培養(yǎng)的人肝細(xì)胞或胎肝細(xì)胞是研究嗜肝性病毒自然感染和復(fù)制的最佳方式,但由于胎肝細(xì)胞的分化程度影響著其對肝炎病毒的易感性,因此用原代人肝細(xì)胞研究肝炎病毒進(jìn)入細(xì)胞的早期感染過程以及由此引起的細(xì)胞先天免疫等方面具有不可比擬的優(yōu)勢。人肝細(xì)胞屬于高度分化的類上皮細(xì)胞。體外培養(yǎng)的人肝細(xì)胞生存期短,很快失去增值分化能力,細(xì)胞衰老、死亡。細(xì)胞的生存壽命與細(xì)胞內(nèi)端粒的長度密切相關(guān)。端粒位于染色體末端,由... 

【文章來源】：中國人民解放軍軍事科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

HCV基因結(jié)構(gòu)及復(fù)制子結(jié)構(gòu)（R.Bartenschlager,2007）

前言圖2 人肝嵌合鼠（H. Barth et al. 2008）血清中的病毒是以一種復(fù)合物的形式存在[16,17]，來源于血清中的病毒顆粒不同于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞所產(chǎn)生的病毒，其與靶細(xì)胞的結(jié)合和穿入具有本身的特點(diǎn)。用HBV或HCV陽性血清直接感染人肝細(xì)胞是最理想的方式[18,19]，采用這種感染方式可以研究不同基因型嗜肝病毒的感染機(jī)制、耐藥機(jī)制，篩選肝細(xì)胞表面病毒感染的相關(guān)分子以及細(xì)胞在病毒作用下的先天免疫反應(yīng)等。由于人肝細(xì)胞來源有限、體外培養(yǎng)困難以及它在嗜肝性病毒感染研究中的重要作用，本研究應(yīng)用 hTERT 轉(zhuǎn)染人原代成體肝細(xì)胞，對其進(jìn)行修飾，通過激活細(xì)胞本身的端粒酶來延長人肝細(xì)胞的體外存活時(shí)間，建立肝炎病毒體外感染細(xì)胞模型

圖 1-1 體外培養(yǎng)肝細(xì)胞克隆的生成及其擴(kuò)大培養(yǎng)（100×）A：分離肝細(xì)胞(未加紅細(xì)胞裂解液)；B~H：培養(yǎng) 1~7 天的肝細(xì)胞克隆形態(tài)；I：肝細(xì)胞克隆的擴(kuò)大培養(yǎng)3.2 肝臟特異性基因的 mRNA 分析瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，提取的RNA三條帶清晰可見，無降解。以隨機(jī)引物Oligo d (T)15反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈，然后用設(shè)計(jì)的針對肝特異性基因的引物擴(kuò)增肝特異性表達(dá)基因ALB、AAT、HGF、CK18、TF、AFP和GS的mRNA，結(jié)果顯示，在培養(yǎng) 7 天的肝細(xì)胞內(nèi)可檢測到肝特異性基因ALB、AAT、 HGF、CK18、TF和GS的mRNA，而未檢測到原癌基因AFP的mRNA（圖 1-2），各擴(kuò)增片段與所預(yù)期的大小一致。


本文編號：2914520