由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）和丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）等人嗜肝病毒感染所導(dǎo)致的急、慢性病毒性肝炎,以及由此發(fā)展成的肝硬化和肝癌是嚴重危害人類健康的重大傳染性疾病。目前全球至少有3.6億HBV慢性感染者和1.7億HCV感染者,每年由于HBV和HCV感染導(dǎo)致死亡的人數(shù)達1500萬。過去的十多年間,雖然在預(yù)防和治療急、慢性病毒性肝炎方面取得了一定進展,但也帶來了許多問題,其中比較突出的是缺乏特效治療藥物以及耐藥性病毒株的出現(xiàn),而制約這一工作進程的難題之一是沒有適用于藥物篩選的肝炎病毒體外感染細胞模型和實驗動物評價模型。用肝炎病毒陽性血清直接感染原代培養(yǎng)的人肝細胞或胎肝細胞是研究嗜肝性病毒自然感染和復(fù)制的最佳方式,但由于胎肝細胞的分化程度影響著其對肝炎病毒的易感性,因此用原代人肝細胞研究肝炎病毒進入細胞的早期感染過程以及由此引起的細胞先天免疫等方面具有不可比擬的優(yōu)勢。人肝細胞屬于高度分化的類上皮細胞。體外培養(yǎng)的人肝細胞生存期短,很快失去增值分化能力,細胞衰老、死亡。細胞的生存壽命與細胞內(nèi)端粒的長度密切相關(guān)。端粒位于染色體末端,由... 

【文章來源】：中國人民解放軍軍事科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

HCV基因結(jié)構(gòu)及復(fù)制子結(jié)構(gòu)（R.Bartenschlager,2007）

前言圖2 人肝嵌合鼠（H. Barth et al. 2008）血清中的病毒是以一種復(fù)合物的形式存在[16,17]，來源于血清中的病毒顆粒不同于轉(zhuǎn)基因細胞所產(chǎn)生的病毒，其與靶細胞的結(jié)合和穿入具有本身的特點。用HBV或HCV陽性血清直接感染人肝細胞是最理想的方式[18,19]，采用這種感染方式可以研究不同基因型嗜肝病毒的感染機制、耐藥機制，篩選肝細胞表面病毒感染的相關(guān)分子以及細胞在病毒作用下的先天免疫反應(yīng)等。由于人肝細胞來源有限、體外培養(yǎng)困難以及它在嗜肝性病毒感染研究中的重要作用，本研究應(yīng)用 hTERT 轉(zhuǎn)染人原代成體肝細胞，對其進行修飾，通過激活細胞本身的端粒酶來延長人肝細胞的體外存活時間，建立肝炎病毒體外感染細胞模型

圖 1-1 體外培養(yǎng)肝細胞克隆的生成及其擴大培養(yǎng)（100×）A：分離肝細胞(未加紅細胞裂解液)；B~H：培養(yǎng) 1~7 天的肝細胞克隆形態(tài)；I：肝細胞克隆的擴大培養(yǎng)3.2 肝臟特異性基因的 mRNA 分析瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，提取的RNA三條帶清晰可見，無降解。以隨機引物Oligo d (T)15反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈，然后用設(shè)計的針對肝特異性基因的引物擴增肝特異性表達基因ALB、AAT、HGF、CK18、TF、AFP和GS的mRNA，結(jié)果顯示，在培養(yǎng) 7 天的肝細胞內(nèi)可檢測到肝特異性基因ALB、AAT、 HGF、CK18、TF和GS的mRNA，而未檢測到原癌基因AFP的mRNA（圖 1-2），各擴增片段與所預(yù)期的大小一致。


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