本文關(guān)鍵詞：microRNA-30a-5p通過抑制自噬阻止肝星狀細(xì)胞激活，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)是肝臟在受到諸如病毒、毒物、藥物、酒精以及免疫等內(nèi)外因素的持續(xù)刺激時引起的以細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)過度沉積為主要特征的慢性肝臟疾病,細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積是肝纖維化發(fā)生的基礎(chǔ),而肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSCs)的激活是發(fā)生肝纖維化的中心環(huán)節(jié)。在正常情況下的HSCs處于靜止?fàn)顟B(tài),當(dāng)肝臟受到各種致病因子刺激時,HSCs被激活轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細(xì)胞,激活后的HSCs發(fā)生一系列的變化,如大脂滴消失,細(xì)胞增殖加快,膠原開始大量沉積。與此同時,HSCs的激活伴隨著“自噬潮”的發(fā)生,自噬抑制劑會在一定程度上阻止HSCs向肌成纖維樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。自噬(autophagy)是一種細(xì)胞自我吞噬的現(xiàn)象,當(dāng)細(xì)胞處于饑餓或應(yīng)激狀態(tài)下,細(xì)胞內(nèi)一些功能失調(diào)或者生產(chǎn)過剩的細(xì)胞器會被包裹形成自噬體,這些自噬體與溶酶體融合而發(fā)生降解,降解的產(chǎn)物經(jīng)再利用釋放ATP,為細(xì)胞應(yīng)對外界壓力提供足夠的能量。microRNA是一種小分子單鏈非編碼RNA,它通過堿基互補(bǔ)配對與靶基因m RNA 3′非編碼區(qū)(UTR)結(jié)合,抑制m RNA翻譯,從而實現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的效果。目前已發(fā)現(xiàn)成熟的mi RNA有35828種,調(diào)控著人類大約1/3的基因表達(dá)。mi RNA-30生物學(xué)作用十分廣泛,目前諸多研究證明mi RNA-30參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和免疫;參與機(jī)體生長、衰老等過程的調(diào)控,并在疾病尤其在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。mi RNA-30a-5p是mi RNA-30的家族成員之一,現(xiàn)已證實在某些腫瘤細(xì)胞中它的靶基因之一是自噬相關(guān)蛋白Beclin-1,mi RNA-30a-5p通過抑制Beclin-1的表達(dá)實現(xiàn)對自噬的抑制作用。miRNA在諸多生理、病理過程中發(fā)揮著重要作用,但它與HSCs激活方面的研究甚少。對于mi RNA是否可作為治療肝纖維化的潛在方法,本實驗建立了mi RNA-30a-5p過表達(dá)和敲低的模型。目的:研究mi RNA-30a-5p的表達(dá)對HSCs激活的影響,并對其機(jī)制進(jìn)行初步探討方法:本實驗通過體外培養(yǎng)HSCs,應(yīng)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染mi RNA-30a-5p激動劑(mi RNA-30a-5p mimic)和mi RNA-30a-5p抑制劑(mi RNA-30a-5p inhibitor),在細(xì)胞水平探討mi RNA-30a-5p對HSCs自噬和激活的影響。應(yīng)用人血小板衍生生長因子(PDGF-BB)作為自噬誘導(dǎo)劑,3-甲基腺嘌呤(3-MA)作為自噬的抑制劑,在mi R-30a-5p作用下通過調(diào)節(jié)自噬來觀察mi RNA-30a-5p對HSCs激活的影響。通過real-time PCR(RT-PCR)技術(shù)檢測m RNA的表達(dá);Western blot技術(shù)檢測細(xì)胞中蛋白的變化;用吖啶橙染色法觀察自噬酸性小體的形成;細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色法檢測自噬發(fā)生時自噬標(biāo)志性蛋白LC3的改變。結(jié)果:1應(yīng)用western blot技術(shù)檢測PDGF干預(yù)終濃度分別為0 ng/ml組、10ng/ml組、20 ng/ml組、40 ng/ml組中細(xì)胞蛋白的表達(dá)情況。統(tǒng)計蛋白灰度值分析α-SMA在4組中的表達(dá)分別為0.86±0.02、0.95±0.04、1.5±0.14和1.00±0.09;Collagen-I在4組中的表達(dá)分別為0.39±0.02、0.41±0.02、0.51±0.02和0.42±0.02;Beclin-1在4組中的表達(dá)分別為0.14±0.02、0.17±0.02、0.40±0.03和0.24±0.01;LC3BII與LC3BI蛋白比值在4組中的情況3.22±0.38、3.88±0.30、8.65±0.31和4.41±0.43。在PDGF終濃度為20 ng/ml時對HSCs自噬和激活的作用最明顯(P0.05),因此,選擇20ng/ml作為本實驗PDGF干預(yù)濃度。2應(yīng)用western blot技術(shù)檢測PDGF 12小時干預(yù)組、24小時干預(yù)組和48小時干預(yù)組蛋白的表達(dá)情況。統(tǒng)計蛋白灰度比值分析α-SMA在3組中表達(dá)分別為0.70±0.03、0.35±0.03和0.25±0.02;Beclin-1在3組中的表達(dá)分別為1.35±0.21、0.62±0.04和0.30±0.02。在PDGF干預(yù)12小時時對HSCs自噬和激活的作用最明顯(P0.05),因此,選擇12小時做為本實驗PDGF的干預(yù)時間。3應(yīng)用RT-PCR檢測mi RNA-30a-5p的表達(dá)情況,結(jié)果表明HSCs中mi RNA-30a-5p在PDGF干預(yù)組的表達(dá)較對照組顯著降低(0.34±0.02 vs.1.00±0.00)(P0.05)。4應(yīng)用RT-PCR檢測在HSCs中轉(zhuǎn)染不同終濃度(對照組、30 nmol/L組、50 nmol/L組和100 nmol/L組)的mi RNA-30a-5p mimic后的轉(zhuǎn)染效率,分別為1.00±0.00、3.12±0.08、3.40±0.16和6.67±0.25,結(jié)果顯示在mi RNA-30a-5p mimic終濃度為100 nmol/L組轉(zhuǎn)染效率最高(P0.01),因此,選擇100 nmol/L作為本實驗mi RNA-30a-5p mimic的處理濃度。5應(yīng)用western blot技術(shù)檢測HSCs中mi RNA-30a-5p對照組、mi RNA-30a-5p mimic組、mi RNA-30a-5p對照+PDGF組、mi RNA-30a-5p mimic+PDGF組細(xì)胞中蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示在mi RNA-30a-5p組Collagen-I、Beclin-1、LC3BII/LC3BI的表達(dá)均較對照組顯著降低(1.39±0.20vs.2.89±0.08,10.13±0.56 vs.13.19±0.44,0.15±0.04 vs.0.80±0.08)(P0.05),P62表達(dá)較對照組表達(dá)升高(1.21±0.13 vs.0.97±0.01)(P0.05),對HSCs進(jìn)行PDGF處理后效果更明顯。應(yīng)用RT-PCR方法檢測α-SMA、PDGFR-β、DDR2其結(jié)果與western blot結(jié)果一致。6應(yīng)用RT-PCR檢測在HSCs中轉(zhuǎn)染不同終濃度(inhibitor對照組、20 nmol/L組、50 nmol/L組和100 nmol/L組)的mi RNA-30a-5p inhibitor后的轉(zhuǎn)染效率,分別為1.00±0.00、0.13±0.03、0.08±0.01和0.21±0.02,結(jié)果顯示在mi RNA-30a-5p inhibitor終濃度為50 nmol/L組轉(zhuǎn)染效率最高(P0.01),因此,選擇50 nmol/L作為本實驗mi RNA-30a-5p inhibitor的處理濃度。7應(yīng)用western blot技術(shù)檢測mi RNA-30a-5p inhibitor對照組、mi RNA-30a-5p inhibitor組細(xì)胞中蛋白的表達(dá)情況。統(tǒng)計蛋白灰度比值,結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染mi RNA-30a-5p inhibitor組中α-SMA、Collagen-I、Beclin-1的表達(dá)水平較對照組明顯升高(0.07±0.01 vs.0.03±0.01,0.15±0.06 vs.0.08±0.02,0.13±0.03 vs.0.07±0.01)(P0.01)。8應(yīng)用吖啶橙染色方法檢測觀察mi RNA-30a-5p mimic對照組、mi RNA-30a-5p mimic組、mi RNA-30a-5p mimic對照+PDGF組、mi RNA-30a-5p mimic+PDGF組;mi RNA-30a-5p inhibitor對照組、mi RNA-30a-5p inhibitor組中酸性自噬囊泡的變化。結(jié)果顯示mi RNA-30a-5p mimic組的紅色熒光較mi RNA-30a-5p mimic對照組弱,在PDGF處理組對比更加顯著。mi RNA-30a-5p inhibitor組的紅色熒光較mi RNA-30a-5p inhibitor對照組明顯增強(qiáng)。9應(yīng)用熒光免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測自噬標(biāo)志蛋白LC3的表達(dá)情況。結(jié)果顯示mi RNA-30a-5p mimic組LC3綠色熒光斑點較對照組表達(dá)量少且彌散性分布于胞漿內(nèi)。10應(yīng)用western blot技術(shù)分別檢測對照組、3-MA組中Collagen-I、Beclin-1的表達(dá)。結(jié)果顯示在3-MA干預(yù)組中Collagen-I、Beclin-1的表達(dá)較對照組均降低(0.05±0.01 vs 0.09±0.01,0.09±0.01 vs.0.19±0.03)(P0.05)。11應(yīng)用western blot技術(shù)分別檢測mi RNA-30a-5p inhibitor對照組、mi RNA-30a-5p inhibitor組、mi RNA-30a-5p inhibitor對照+3-MA組、mi RNA-30a-5p inhibitor+3MA組蛋白表達(dá),統(tǒng)計蛋白灰度比值,結(jié)果顯示mi RNA-30a-5p inhibitor組中α-SMA和LC3BII/LC3BI蛋白比值明顯高于對照組水平(3.05±0.17 vs.1.93±0.08,0.06±0.00 vs.0.04±0.00)(P0.05);P62的表達(dá)水平低于對照組(1.40±0.49 vs.3.20±0.30)(P0.01)。而應(yīng)用3-MA干預(yù)后上述蛋白變化無顯著差異(1.95±0.13 vs.1.89±0.15,0.04±0.00vs.0.04±0.00,0.95±0.12 vs.1.11±0.12)(NS0.05)。12應(yīng)用生物信息學(xué)軟件mi Randa,Target Scan,Pic Tar查找mi RNA-30a-5p與自噬相關(guān)的潛在靶點,篩選后取交集,確定Beclin-1為mi RNA-30a-5p的作用靶點。結(jié)論:mi RNA-30a-5p可以特異性的作用于自噬相關(guān)蛋白Beclin-1,通過減弱自噬的發(fā)生,從而抑制HSCs的激活。
【關(guān)鍵詞】：肝星狀細(xì)胞 自噬 miRNA-30a-5p PDGF 3-MA 肝纖維化
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R575.2
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-12
• 英文縮寫12-13
• 前言13-14
• 材料與方法14-24
• 結(jié)果24-28
• 附圖28-39
• 討論39-41
• 結(jié)論41
• 參考文獻(xiàn)41-43
• 綜述 microRNA在慢性肝病和肝癌中的作用43-59
• 參考文獻(xiàn)52-59
• 致謝59-60
• 個人簡歷60

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 萬星勇;虞朝輝;厲有名;;微小RNA在脂肪性肝病研究中的新進(jìn)展[J];國際消化病雜志;2012年05期

2 王曉丹;石慧;肖和杰;張艷瓊;;MicroRNA-29與肝纖維化[J];武漢大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2014年03期

3 楊婕;劉朝奇;;microRNA在非酒精性脂肪性肝病中的作用[J];生命的化學(xué);2014年06期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 陳毅鵬;酒精性肝病特異性miRNAs表達(dá)譜及下游調(diào)控基因研究[D];浙江大學(xué);2014年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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2 董倩倩;胃腸癌組織中microRNA-375基因DNA甲基化與PDK1表達(dá)研究[D];遼寧醫(yī)學(xué)院;2013年

3 王秀芳;淮安市區(qū)退休職工脂肪性肝病患病率調(diào)查以及miR-143對HepG2細(xì)胞脂代謝的影響[D];蚌埠醫(yī)學(xué)院;2014年

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5 許曉琴;miR-152抑制Wnt10b影響人正常肝細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞脂肪變性的分子機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：microRNA-30a-5p通過抑制自噬阻止肝星狀細(xì)胞激活，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：290258