本文關(guān)鍵詞：EC-SOD在大鼠肝臟缺血再灌注損傷中的表達(dá)變化，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：臨床上在進(jìn)行肝臟手術(shù)如肝臟部分切除、肝臟移植以及處理嚴(yán)重肝臟外傷時往往需要暫時性阻斷肝臟血流一段時間后再重新恢復(fù)其血液供應(yīng)。在這個過程中就造成了肝臟的缺血再灌注損傷(hepatic ischemia reperfusion injury,HIRI)。HIRI是肝臟外科手術(shù)過程中一種常見的病理生理現(xiàn)象。肝臟的缺血再灌注可引起嚴(yán)重的肝細(xì)胞損傷和肝功能障礙,這也是導(dǎo)致術(shù)后肝功能衰竭和病人預(yù)后較差的重要原因之一。研究已證實,導(dǎo)致這種損傷的主要機制之一為氧化應(yīng)激反應(yīng)。缺血再灌注時機體會產(chǎn)生大量活性氧自由基(reac-tive oxygen species,ROS)。ROS包括超氧陰離子(O2-)、羥自由基(OH)和過氧化氫(H2O2)等。ROS的化學(xué)性質(zhì)非�；顫�,可以破壞細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、DNA和脂類等生物大分子,引起細(xì)胞死亡。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutases,SOD)是機體內(nèi)一種重要的抗氧化酶,負(fù)責(zé)清除O2-,它能將O2-轉(zhuǎn)化成H2O2和氧,在機體抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中具有重要作用。在哺乳動物SOD共有三種亞型:Mn-SOD存在于線粒體,Cu/Zn-SOD主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。細(xì)胞外超氧化物歧化酶(extracellular SOD,EC-SOD)是唯一位于細(xì)胞外的SOD亞型,并通過其肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(heparin-binding domain,HBD)與細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)相結(jié)合。其次,EC-SOD也存在于細(xì)胞外液,如血清,腦脊髓液,腹水和滑膜液等。以往對于SOD的功能研究主要集中在Mn-SOD和Cu/Zn-SOD的抗氧化作用。但最近的研究表明EC-SOD可能具有更強的抗氧化應(yīng)激和抗炎作用。EC-SOD在肝臟缺血再灌注損傷模型的表達(dá)如何變化,是否也發(fā)揮了抗氧化作用,有待證實。本研究通過無損傷血管夾夾閉通往大鼠肝左葉、肝中葉的血管和膽管蒂30 min后松開血管夾,制造大鼠70%肝臟缺血再灌注損傷模型,6小時后觀察肝臟組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變、MDA含量變化以及EC-SOD m RNA水平和蛋白水平的變化,進(jìn)一步探討缺血再灌注損傷過程中肝臟組織的氧化應(yīng)激狀態(tài)以及EC-SOD的抗氧化作用,為肝臟缺血再灌注損傷的防治提供一條新思路。目的:觀察大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型肝組織內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài),觀察EC-SOD的表達(dá)變化,探討其在抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中的作用。方法:1動物分組及缺血再灌注損傷模型的制備Wister雄性大鼠12只,體重200±10 g,由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,隨機分為兩組:對照組(Con)和缺血再灌注損傷組(HIRI),用6%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(5ml/kg),參照Kohli等人的方法,分離肝血管和膽管蒂,以無創(chuàng)傷性血管夾夾閉通往肝左葉、肝中葉的血管和膽管蒂。30分鐘后去掉血管夾,恢復(fù)肝臟血液供應(yīng),制造70%肝實質(zhì)的肝臟缺血再灌注損傷模型。對照組大鼠只分離血管和膽管蒂并不夾閉。6小時后收集血液,3000rpm離心10min,分離血清,用于ALT(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)測定;處死大鼠取肝臟,一部分4%多聚甲醛中固定進(jìn)行HE染色,觀察肝組織形態(tài)學(xué)改變。一部分置于液氮中用于EC-SOD m RNA水平和蛋白水平檢測,以及MDA含量測定2測定指標(biāo)及方法2.1血清ALT水平測定血清ALT水平由全自動生化分析儀測定。2.2 HE染色觀察大鼠肝臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)肝組織經(jīng)常規(guī)脫水、透明,石蠟包埋后,切片厚約5μm,蘇木精伊紅染色,日本產(chǎn)Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)變化并進(jìn)行圖象分析。2.3大鼠肝組織MDA含量測定將從-70℃冰箱中取出的肝組織按照10mg/100μl加入預(yù)冷的勻漿緩沖液(50mmol/L磷酸鉀緩沖液,PH7.4,1mmol/L鹽酸苯甲脒,1mmol/L PMSF,0.1%Tween-20,0.5mol/L Na Cl,1mmol/L EDTANa3,5mmol/Lβ-巰基乙醇),冰浴中勻漿,勻漿液4000rpm 4℃離心20min,取上清即制成10%肝組織勻漿,肝組織勻漿內(nèi)MDA含量采用南京建成丙二醛(MDA)測定試劑盒測定。2.4大鼠肝組織EC-SOD m RNA水平測定采用Trizol提取肝組織總RNA。約3μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成c DNA。以GAPDH為內(nèi)參照,進(jìn)行RT-PCR。分別以EC-SOD的擴(kuò)增產(chǎn)物與GAPDH灰度值之比表示m RNA的相對表達(dá)量。2.5大鼠肝組織EC-SOD蛋白水平測定采用Western blot法測定大鼠肝組織EC-SOD蛋白水平。將大鼠肝組織制成勻漿,離心后取上清。用改良Lowry法進(jìn)行蛋白總量測定.電泳的蛋白上樣量為56 ug.經(jīng)過轉(zhuǎn)膜和封閉處理后,在PVDF膜上加入兔抗EC-SOD抗體,室溫靜置過夜。再加入熒光標(biāo)記的抗兔Ig G抗體.在雙色紅外線成像系統(tǒng)掃描照相并進(jìn)行圖像數(shù)值分析。結(jié)果:1大鼠肝組織的形態(tài)學(xué)改變光學(xué)顯微鏡下可見Con組大鼠肝細(xì)胞排列成條索狀,圍繞中央靜脈成放射狀排列,肝索間肝血竇大小均勻,無明顯擴(kuò)張充血。而HIRI組大鼠的肝組織淤血嚴(yán)重,肝血竇明顯擴(kuò)張充血,肝細(xì)胞受壓萎縮,部分肝細(xì)胞胞漿染色變淺,胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡變性且空泡數(shù)量較多,但壞死不明顯。2血清ALT水平測定Con組大鼠血清中ALT為20.03±5.23U/L,而HIRI組血清ALT為87.43±9.06 U/L。HIRI組大鼠血清ALT水平明顯高于Con組(P0.01)。3肝漿內(nèi)MDA的含量勻漿內(nèi)的MDA含量為12.75±2.25 mmol/g。HIRI組大鼠肝勻漿內(nèi)的MDA含量明顯高于Con組(P0.01)。4肝組織EC-SOD mRNA的相對表達(dá)量采用RT-PCR的方法測定大鼠肝組織內(nèi)EC-SOD m RNA的相對表達(dá)量。Con組肝組織內(nèi)EC-SOD m RNA的相對表達(dá)量為0.68±0.11,HIRI肝組織內(nèi)EC-SOD m RNA的相對表達(dá)量為1.13±0.18,HIRI組大鼠肝組織內(nèi)EC-SOD m RNA水平明顯高于Con組(P0.01)。說明HIRI組大鼠肝組織內(nèi)EC-SOD的基因表達(dá)水平升高。5大鼠肝組織EC-SOD蛋白水平Con EC-SOD 0.74±0.14HIRI大鼠肝組織內(nèi)EC-SOD的蛋白表達(dá)水平為1.10±0.22。HIRI組EC-SOD蛋白水平明顯高于對照組(P0.01)。說明HIRI組大鼠肝組織內(nèi)EC-SOD的蛋白表達(dá)水平升高。結(jié)論:1結(jié)扎肝左、中血管和膽管蒂可成功建立大鼠70%肝臟缺血再灌注損傷模型。2肝臟缺血再灌注損傷模型的肝臟組織已遭受氧化應(yīng)激損傷,肝臟功能嚴(yán)重受損,EC-SOD基因和蛋白表達(dá)水平均明顯增強。提示EC-SOD在肝臟缺血再灌注損傷過程中可能發(fā)揮了抗氧化應(yīng)激作用,對肝細(xì)胞具有保護(hù)功能。
【關(guān)鍵詞】：缺血再灌注損傷 EC-SOD ALT HE 氧化應(yīng)激
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R575
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 前言13-14
• 材料與方法14-22
• 結(jié)果22-23
• 附圖23-30
• 附表30-32
• 討論32-33
• 結(jié)論33
• 參考文獻(xiàn)33-36
• 綜述 氧化應(yīng)激、促氧化劑與抗氧化劑的研究進(jìn)展36-47
• 參考文獻(xiàn)42-47
• 致謝47-48
• 個人簡歷48

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 胡禮宏;韓新生;郭建榮;;雌激素與雌激素受體在大鼠肝臟缺血再灌注損傷中的作用[J];中國臨床藥理學(xué)雜志;2011年03期

2 ;Alanyl-glutamine dipeptide inhibits hepatic ischemiareperfusion injury in rats[J];World Journal of Gastroenterology;2006年09期

3 張芳芳;鄭一凡;�；劬�;沈筱筠;朱心強;;山奈酚和槲皮素對大鼠細(xì)胞色素P450酶活性的影響[J];浙江大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2006年01期

  本文關(guān)鍵詞：EC-SOD在大鼠肝臟缺血再灌注損傷中的表達(dá)變化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：289777