發(fā)布時間：2020-12-02 22:23

　　丙型肝炎（Hepatitis C Virus, HCV）是一個全球性危害人類健康的重要病原體,感染后機體極易導致慢性肝炎,并引起肝纖維化、肝硬化、肝壞死,最終導致肝癌。目前對于丙型肝炎病毒致病機制的了解仍舊非常有限。研究發(fā)現(xiàn)丙型肝炎病毒的致病性除了病毒本身因素外,病毒蛋白與宿主細胞蛋白的相互作用在其中發(fā)揮重要的作用。在組成病毒的結構蛋白（Struotural Protein）口非結構蛋白中,非結構蛋白NS5A通過與細胞蛋白的相互作用在信號轉導、胞內(nèi)物質轉運、抗細胞凋亡以及其它的一些方面發(fā)揮了重要作用,研究表明在HCV病毒感染宿主細胞后,在細胞內(nèi)裝配。其中NS5A中的dmainⅡ domainⅢ區(qū)域也影響了HCV的復制,并且許多相互作用的后果都能維持或促進病毒在細胞內(nèi)的持續(xù)復制,但其詳細機制有待進一步明確。我們通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選人類肝臟cDNA文庫時得知domainⅡ-Ⅲ與USF2之間有可能存在相互作用,鑒于這兩種蛋白質在細胞生理功能上的重要性,我們對其相互作用做了進一步的驗證,通過GST融合蛋白沉降技術、免疫共沉淀技術的結果不能證明NS5A domainⅡ-Ⅲ與USF2之間一定存在... 

【文章來源】：湖北大學湖北省

【文章頁數(shù)】：60 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 文獻綜述
    1.1 丙型肝炎病毒非結構蛋白NS5A的研究背景
        1.1.1 丙型肝炎病毒介紹
            1.1.1.1 丙型肝炎病毒的結構和特點
            1.1.1.2 HCV病毒在肝細胞的復制過程
            1.1.1.3 HCV基因組結構
        1.1.2 NS5A基因的結構和定位
        1.1.3 NS5A功能與作用
    1.2 USF概述
        1.2.1 USF2的結構
        1.2.2 USF2的功能與疾病發(fā)生
            1.2.2.1 USF2的自我剪切
            1.2.2.2 USF2與細胞增殖
            1.2.2.3 USF2與糖脂代謝
            1.2.2.4 USF2與腎臟疾病
    1.3 蛋白質相互作用
        1.3.1 研究蛋白質相互作用的意義
        1.3.2 研究蛋白質相互作用的方法
            1.3.2.1 酵母雙雜交系統(tǒng)（yeast two-hybrid system,Y2H system）
            1.3.2.2 GST融合蛋白沉降（GST Pull-Down）技術
            1.3.2.3 免疫共沉淀（immunoprecipation）
    1.4 研究目的
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株、細胞系和質粒
            2.1.1.1 菌株
            2.1.1.2 細胞系
            2.1.1.3 質粒
        2.1.2 培養(yǎng)基
        2.1.3 試劑和酶
        2.1.4 主要緩沖液
        2.1.5 儀器和設備
    2.2 方法
        2.2.1 引物序列
        2.2.2 基因擴增體系
        2.2.3 基因擴增條件
        2.2.4 大腸桿菌高效率感受態(tài)細胞制備
        2.2.5 大腸桿菌的快速轉化
        2.2.6 大腸桿菌的常規(guī)轉化
        2.2.7 質粒DNA的提取與純化
            2.2.7.1 堿裂解法抽提質粒DNA
            2.2.7.2 商業(yè)化試劑盒抽提質粒DNA
        2.2.8 質粒酶切
        2.2.9 SDS-PAGE檢測表達蛋白
        2.2.10 免疫印記檢測表達蛋白
        2.2.11 HEK293細胞的復蘇
        2.2.12 HEK293細胞的凍存
        2.2.13 哺乳動物細胞系HEK293的組織培養(yǎng)
        2.2.14 哺乳動物細胞的轉染
        2.2.15 應用酵母雙雜交篩選人類肝臟有限cDNA文庫的步驟
            2.2.15.1 有限5×cDNA文庫的制備
            2.2.15.2 酵母菌的質粒DNA的小量轉化
            2.2.15.3 酵母菌的人類肝臟cDNA文庫轉化
            2.2.15.4 啤酒酵母中質粒DNA的抽提
            2.2.15.5 一步法轉化酵母
            2.2.15.6 酵母大平板的影印
            2.2.15.7 酵母LacZ顯色
        2.2.16 GST pull down步驟
        2.2.17 免疫共沉淀步驟
3 結果與分析
    3.1 酵母雙雜交結果
        3.1.1 NS5A domainⅡ-Ⅲ和Ⅲ自身激活作用的檢測
        3.1.2 以NS5A domainⅡ-Ⅲ和Ⅲ為“誘餌”的篩庫結果
        3.1.3 Blast序列比對結果
        3.1.4 在二缺平板SC-Leu-Trp篩選結果
        3.1.5 酵母LacZ顯色結果
    3.2 NS5AdomainⅡ-Ⅲ,Ⅲ和USF2全長基因的擴增
    3.3 GST-pulldown結果
        3.3.1 NS5AdomainⅡ-Ⅲ和Ⅲ與USF2的相互作用對GST-pull down重組質粒的構建
        3.3.2 NS5AdomainⅡ-Ⅲ,Ⅲ與USF2的原核表達純化結果
        3.3.3 GST-pull down
    3.4 免疫共沉淀驗證NS5A與USF2之間的相互作用
4 討論與展望
    4.1 討論
        4.1.1 HCV NS5A domainⅡ-Ⅲ與USF2的相互作用
        4.1.2 HCV NS5A domainⅡ-Ⅲ與USF2相互作用的生理意義
    4.2 展望
參考文獻
致謝



本文編號：2895659