目的:探究microRNA-22在高脂環(huán)境下調(diào)控肝細胞衰老的作用及其分子機制,為非酒精性脂肪性肝病尋找有效干預(yù)靶點提供基礎(chǔ)。方法:(1)將BALB/c小鼠隨機分成2組:正常飲食組和高脂飲食組,每組10只。高脂飲食組用高脂飲食喂養(yǎng)誘導非酒精性脂肪性肝病。20W后,處理老鼠,稱量小鼠體重、肝重及附睪脂肪重量;生化試劑盒檢測各組小鼠肝甘油三酯的含量;蘇木紫-伊紅染色檢測肝脂肪變性程度;用半定量PCR檢測脂代謝相關(guān)基因Lxr、Acsl、Acc1、Chrebp以及P21的mRNA水平;(2)用衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色檢測組織肝細胞衰老情況;免疫熒光染色檢測P53、SIRT1的蛋白表達,實時定量PCR技術(shù)檢測miR-22和Sirt1的相對表達量;流式微球技術(shù)檢測NAFLD小鼠血清中炎性因子IL2、IL4、IL6、IFNγ、TNF、IL17A和IL10的表達。(3)細胞學實驗,應(yīng)用MTT法確定棕櫚酸(PA)的最佳濃度;β-半乳糖苷酶染色檢測PA對BNL.CL2細胞衰老的作用;qPCR檢測PA處理BNL.CL2細胞后細胞周期及衰老相關(guān)基因P53、P21、Cdk2、Cdk6的相對表達量,以及miR-22、Sirt1和SASP炎性因子表達水平;免疫熒光染色檢測PA處理BNL.CL2細胞后SIRT1、P53、P21的蛋白表達情況(4)瞬時轉(zhuǎn)染miR-22 mimics到BNL.CL2肝細胞,檢測衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶,SIRT1、P53、P21、CDK2、CDK6以及SASP相關(guān)炎性因子的表達,方法如前所述。(5)瞬時轉(zhuǎn)染miR-22 inhibitor至BNL.CL2肝細胞,6 h后,換PA處理84 h,檢測衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶、SIRT1、P53、P21、CDK2、CDK6以及SASP炎性因子的表達,方法如前所述。結(jié)果:(1)高脂飲食的BALB/c小鼠表現(xiàn)為體重、肝重、附睪脂肪重量增加,肝甘油三酯含量上調(diào)等脂質(zhì)沉積的表現(xiàn);HE染色顯示肝脂肪變性,脂代謝異常的脂肪性肝病表現(xiàn)。(2)衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶及衰老相關(guān)蛋白增加;免疫熒光染色顯示在HFD組P53表達增加、SIRT1在核的表達下調(diào);qPCR顯示在HFD組miR-22表達增加和Sirt1表達降低;小鼠血清中炎性因子IL6、TNF的蛋白表達明顯增高。(3)MTT法及β-半乳糖苷酶染色檢測顯示PA濃度為100μM時,作用BNL.CL2細胞84 h后,藍染的陽性衰老細胞增多。實時定量PCR檢測PA處理BNL.CL2肝細胞后,衰老相關(guān)基因P53、P21表達增加,Cdk2、Cdk6及Sirt1的表達降低,miR-22及SASP炎性因子表達上調(diào);細胞免疫熒光染色顯示PA處理BNL.CL2肝細胞后,P53、P21在核表達增加,SIRT1在胞核表達減少,在胞漿表達增多。(4)BNL.CL2細胞瞬時轉(zhuǎn)染miR-22 mimics后,SIRT1表達下調(diào)且在胞核的表達較少,同PA處理結(jié)果趨勢一致,衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶及衰老相關(guān)基因和蛋白增加,細胞周期相關(guān)基因表達下調(diào),SASP相關(guān)炎性因子上調(diào)。(5)BNL.CL2細胞瞬時轉(zhuǎn)染miR-22 inhibitor后,與PA+microRNA inhibitor N.C處理組相比,PA+miR-22 inhibitor組衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶表達減少,SIRT1表達增加且在胞核表達增多,細胞周期相關(guān)基因在mRNA水平表達上調(diào),衰老相關(guān)基因和蛋白下調(diào)。結(jié)論:高脂環(huán)境可誘導肝細胞miR-22高表達,進而抑制SIRT1的活性,導致SASP上調(diào),誘導肝細胞衰老。MiR-22可通過靶向調(diào)控SIRT1/SASP誘導NAFLD發(fā)生發(fā)展,其可能成為NAFLD治療的潛在分子靶點。
【學位單位】：三峽大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R575
【部分圖文】：

圖 1 正常飲食組和高脂飲食組小鼠肝臟病理學表現(xiàn)注：HFD 肝出現(xiàn)明顯的脂滴，CD：正常飲食組，HFD：高脂飲食組，H&E 染色：FLD 小鼠肝脂代謝及炎性因子表達用逆轉(zhuǎn)錄 PCR 對小鼠高脂飲食組及正常飲食組小鼠肝組織中脂代謝相csl、Acc1、Chrebp 等進行了檢測。結(jié)果顯示：與正常飲食組相比，Hhrebp 表達無統(tǒng)計學意義外，Lxr、Acsl、Acc1、Chrebp 其他基因均有明時，在高脂飲食組中 P21 和 Il1α 表達均增高。（見圖 2）圖 2 NAFLD 小鼠肝組織中脂代謝基因及 P21、Il1α 的 mRNA 表達量

圖 1 正常飲食組和高脂飲食組小鼠肝臟病理學表現(xiàn)（注：HFD 肝出現(xiàn)明顯的脂滴，CD：正常飲食組，HFD：高脂飲食組，H&E 染色：200×）1.3NAFLD 小鼠肝脂代謝及炎性因子表達利用逆轉(zhuǎn)錄 PCR 對小鼠高脂飲食組及正常飲食組小鼠肝組織中脂代謝相關(guān)基因Lxr、Acsl、Acc1、Chrebp 等進行了檢測。結(jié)果顯示：與正常飲食組相比，HFD 模型組除 Chrebp 表達無統(tǒng)計學意義外，Lxr、Acsl、Acc1、Chrebp 其他基因均有明顯的變化。同時，在高脂飲食組中 P21 和 Il1α 表達均增高。（見圖 2）

22圖 3 形態(tài)學觀察肝細胞衰老表征A.HFD 組肝細胞核明顯增大，DAPI 染色：400×，B.HFD 組出現(xiàn)明顯藍染顆粒，達增加，CD：正常飲食組，HFD：高脂飲食組，衰老特異性 β-半乳糖苷酶染色：AFLD 小鼠肝中 P53 表達細胞衰老時 P53 蛋白表達增高，用石蠟切片行間接免疫熒光法檢測小鼠食組肝組織中 P53 蛋白表達。結(jié)果顯示：高脂飲食組肝細胞核內(nèi) P53 的高于正常對照組（見圖 4）。
【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 李陶;龐琪;劉永斌;;外周血microRNA-22水平在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中的表達變化及臨床診斷意義[J];中國醫(yī)刊;2017年01期

2 李陶;龐琪;劉永斌;;抑制microRNA-22可通過調(diào)節(jié)SIRT1表達減輕氧化應(yīng)激引起的血管內(nèi)皮細胞損傷[J];中國衛(wèi)生標準管理;2016年21期

3 張蕊;湯鋒;鄧琳;邢瑩瑩;奚濤;;microRNA-22真核表達載體的構(gòu)建及其在卵巢癌細胞系SKOV-3中的穩(wěn)定表達[J];藥物生物技術(shù);2012年03期

4 高四海;張鶴美;賀金獎;張增利;童建;李冰燕;;1,25-(OH)_2D_3抑制人卵巢癌細胞SKOV-3增殖與調(diào)控microRNA-22的表達有關(guān)[J];營養(yǎng)學報;2014年01期

相關(guān)博士學位論文 前2條

1 楊峰;microRNA-22通過調(diào)控血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化抑制內(nèi)膜新生的作用機制研究[D];浙江大學;2017年

2 吳湘妮;PTEN的表達，調(diào)節(jié)和功能缺陷與系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病機制中B細胞異常有關(guān)[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2013年

相關(guān)碩士學位論文 前2條

1 段麗;高脂誘導肝細胞衰老中microRNA-22的作用及其分子機制[D];三峽大學;2018年

2 杜建奎;MicroRNA-22加重心肌缺血-再灌注損傷的作用及其機制研究[D];第二軍醫(yī)大學;2016年

本文編號：2891024