目的： 原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)是種以肝內(nèi)小膽管進(jìn)行性、非化膿性炎癥為特征的自身免疫性疾病。如何有效治療PBC,改善患者的預(yù)后及生存質(zhì)量是目前研究的熱點(diǎn)。國(guó)外臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)PPAR泛激動(dòng)劑苯扎貝特(Bezafibrate, BF)對(duì)PBC患者有一定療效,但其作用機(jī)制不明。我們前期研究發(fā)現(xiàn)PBC患者外周血中Th17細(xì)胞的表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照組,提示苯扎貝特的療效有可能通過干預(yù)Th17細(xì)胞分化而發(fā)揮作用。本研究擬從PBC患者臨床樣本分析來探討苯扎貝特靶向Thl7細(xì)胞治療PBC,為進(jìn)一步揭示PBC發(fā)病機(jī)理,尋找更具免疫調(diào)節(jié)功能的干預(yù)措施提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。 方法： 1.苯扎貝特影響Thl7細(xì)胞分化最佳濃度的篩選 采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC);免疫磁珠分選技術(shù)(MACS)分選CD4+T細(xì)胞。CD4+T細(xì)胞以1×109/L的密度分4組進(jìn)行培養(yǎng),加入不同濃度的苯扎貝特誘導(dǎo)刺激： (1) medium組; (2)10μM BF組； (3)50μM BF組; (4)100μM BF組; 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)苯扎貝特抑制Thl7細(xì)胞分化的最佳濃度。 2.苯扎貝特體外干預(yù)PBC患者Th17細(xì)胞分化 (1)Ficoll-Hypaque密度梯度離心法及MACS從PBC患者和正常人外周血中分選CD4+T細(xì)胞,不同濃度的苯扎貝特誘導(dǎo)刺激培養(yǎng)： ①medium組 ②50μM BF組 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)苯扎貝特對(duì)Th17細(xì)胞分化的影響。 (2) RT-PCR檢測(cè)PBC患者和正常人外周血中CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)9天后IL-17和INF-γ mRNA的表達(dá)。 (3)ELISA檢測(cè)PBC患者和正正常人外周血中CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)9天后上清液中IL-17和INF-γ表達(dá)水平。 結(jié)果： 1.苯扎貝特在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性抑制正常人外周血Thl7細(xì)胞分化,其中50μM處理后,IL17表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞率最低(0.1%～0.5%),平均0.3%左右,是抑制Th17細(xì)胞分化的最佳濃度。 2.苯扎貝特處理PBC患者和正正常人外周血CD4+T細(xì)胞中IL-17+IFN-γ-,IL-17+IFN-Y+表達(dá)水平較未處理組均顯著降低(P＜0.05)；只表達(dá)IFN-γ的CD4+T細(xì)胞較未處理組均無(wú)明顯差異(P＞0.05)。 3.苯扎貝特處理PBC患者和正常人外周血CD4+T細(xì)胞后,IL-17mRNA表達(dá)水平均明顯低于未處理組(P＜0.05)；而IFN-γ mRNA表達(dá)水平較未處理組均無(wú)明顯差異(P＞0.05)。 4.苯扎貝特處理PBC患者和正正常人外周血CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-17水平較未處理組均顯著降低(P＜0.05),而IFN-γ水平較未處理組均無(wú)明顯差異(P＞0.05)。 結(jié)論： 初步篩選出50洲苯扎貝特是抑制Thl7細(xì)胞分化的最佳濃度；在Th17細(xì)胞極化條件下,苯扎貝特明顯抑制PBC患者外周血中CD4+T細(xì)胞中IL-17表達(dá),而不影響IFN-γ表達(dá)。
【學(xué)位單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2012
【中圖分類】：R575.2
【文章目錄】：
摘要
Abstract
目錄
引言
第一部分 苯扎貝特影響Th17細(xì)胞分化條件的建立
    1.1 主要材料和試劑
    1.2 主要儀器
    1.3 免疫抑制藥
    1.4 研究對(duì)象
    1.5 方法
        1.5.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的獲取
+T細(xì)胞分選'>        1.5.2 CD4⁺T細(xì)胞分選
        1.5.3 細(xì)胞培養(yǎng)
        1.5.4 苯扎貝特對(duì)細(xì)胞增殖的影響
        1.5.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)
    1.6 結(jié)果
        1.6.1 BF對(duì)細(xì)胞增殖的影響
        1.6.2 BF在體外誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化的最佳刺激濃度
    1.7 討論
第二部分 苯扎貝特體外干預(yù)PBC患者Th17細(xì)胞的分化
    2.1 主要試劑與試劑配制
    2.2 主要儀器
    2.3 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本
        2.3.1 PBC患者組
        2.3.2 健康對(duì)照組
    2.4 方法
        2.4.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的獲取
        2.4.2 CD4+T細(xì)胞分選
        2.4.3 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.4.4 熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)IL-17基因的表達(dá)
        2.4.5 ELISA檢測(cè)上清液IL-17含量
        2.4.6 ELISA檢測(cè)上清液IFN-Y含量
        2.4.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    2.5 結(jié)果
+T細(xì)胞培養(yǎng)情況'>        2.5.1. 純化的CD4⁺T細(xì)胞培養(yǎng)情況
+T細(xì)胞中Th17分化'>        2.5.2 在Th17細(xì)胞極化的條件下,BF抑制PBC患者和正常人外周血CD4⁺T細(xì)胞中Th17分化
+T細(xì)胞中IL-17mRNA的表達(dá)'>        2.5.3 BF抑制PBC患者和正常人外周血CD4⁺T細(xì)胞中IL-17mRNA的表達(dá)
    2.6 討論
結(jié)語(yǔ)
參考文獻(xiàn)
附錄
    附錄1：縮略語(yǔ)
    附錄2：主要生化試劑及配制
    附錄3：綜述
在校期間發(fā)表論文情況
致謝

【參考文獻(xiàn)】

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1 張文忠;姚萍;;原發(fā)性膽汁性肝硬化發(fā)病的分子機(jī)制研究進(jìn)展[J];重慶醫(yī)學(xué);2009年21期

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本文編號(hào)：2887957