發(fā)布時(shí)間：2020-11-17 08:39

　　 一、未抗病毒治療的慢性HBV感染者肝內(nèi)HBV ccc DNA耐藥相關(guān)位點(diǎn)變異的檢測(cè) 目的證實(shí)未抗病毒治療的慢性HBV感染者肝內(nèi)HBV ccc DNA存在耐藥相關(guān)位點(diǎn)的變異,了解肝內(nèi)HBV變異病毒株與血中的異同。方法①挑選出85例未經(jīng)抗病毒治療的慢性HBV感染者,留取肝穿組織和血清。②用QIAamp? DNA Mini Kit試劑盒和直接煮沸法分別抽提肝穿組織、血清中的HBV相關(guān)基因。③以不降解質(zhì)粒的ATP依賴DNA酶(PSAD)酶切純化肝穿組織中的HBV DNA。定量酶切前后肝內(nèi)HBV DNA載量以及血清中HBV DNA載量。④檢測(cè)血清乙型肝炎病毒血清免疫標(biāo)志物和血清肝功能生化指標(biāo)(ALT),分析其與HBV含量之間的關(guān)系。⑤應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的兩對(duì)跨雙缺口引物行巢式聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增HBV ccc DNA、兩對(duì)非跨雙缺口引物行巢式PCR擴(kuò)增松弛環(huán)狀DNA(rc DNA)。所有引物擴(kuò)增的片段涵蓋拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋常見(jiàn)已知耐藥位點(diǎn)。⑥應(yīng)用直接測(cè)序法對(duì)巢式PCR的DNA產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序檢測(cè),觀察耐藥相關(guān)變異位點(diǎn)的變異情況。⑦對(duì)比分析肝內(nèi)HBV ccc DNA、HBV rc DNA和血清中HBV DNA的基因序列。結(jié)果肝內(nèi)HBV ccc DNA水平、肝內(nèi)HBV DNA水平以及血清HBV DNA三者之間的關(guān)系呈正相關(guān)(P0.05);肝功能指標(biāo)ALT水平與HBV DNA載量之間沒(méi)有相關(guān)性(P0.05);在85例患者中,HBV ccc DNA耐藥相關(guān)位點(diǎn)變異陽(yáng)性兩例(2.4%):204位點(diǎn)變異一例rtM204I(45號(hào)),214位點(diǎn)變異一例(49號(hào))。另有一例測(cè)序圖譜顯示雜峰(85號(hào))。且相應(yīng)的血清及肝組織HBV DNA中也都發(fā)現(xiàn)同樣變異。結(jié)論在未經(jīng)抗病毒治療的慢性HBV感染者肝內(nèi)HBV ccc DNA中發(fā)現(xiàn)耐藥相關(guān)位點(diǎn)變異,證實(shí)HBV ccc DNA存在耐藥相關(guān)位點(diǎn)自然變異。 二、HBV ccc DNA耐藥相關(guān)位點(diǎn)自然變異病毒株目的基因片段的克隆分析 目的了解出現(xiàn)HBV ccc DNA耐藥相關(guān)位點(diǎn)自然變異的患者體內(nèi)HBV的變異株與野生株所占比例。方法①以第一部分試驗(yàn)出現(xiàn)變異的標(biāo)本(血清及酶切前后肝內(nèi)HBV相關(guān)基因)為克隆模板。巢式PCR法同第一部分。②按照克隆試劑盒的具體步驟(純化、連接、轉(zhuǎn)化等)完成操作。觀察克隆結(jié)果,每份標(biāo)本隨機(jī)挑取50個(gè)單克隆菌落,直接測(cè)序。③對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析,了解每份標(biāo)本的變異株與野生株的比例。結(jié)果①204位點(diǎn)克隆分析:肝內(nèi)HBV ccc DNA ATG/ATT/ATC=10/38/2、肝內(nèi)HBV rc DNA ATG/ATT/ATC=3/45/2、血清HBV DNA ATG/ATT/ATC=0/50/0;②214位點(diǎn)克隆分析:肝內(nèi)HBV ccc DNA GTA/GCT/GTT=20/29/1、肝內(nèi)HBV rc DNA GTA/GCT =5/45、血清HBV DNA GTA/GCT=10/40;③85號(hào)雜峰標(biāo)本克隆分析結(jié)果顯示大部分耐藥相關(guān)位點(diǎn)變異是無(wú)義突變,僅在肝內(nèi)HBV ccc DNA目的基因片段的50例克隆中發(fā)現(xiàn)1例181位點(diǎn)GCT變?yōu)锳CT(rtA181T),在血清HBV DNA目的基因片段的50例克隆中發(fā)現(xiàn)1例250位點(diǎn)ATG變?yōu)镚TG(rtM250V)。結(jié)論肝內(nèi)ccc DNA耐藥相關(guān)位點(diǎn)發(fā)生自然變異的患者體內(nèi)病毒株為變異株與野生株混合存在,肝內(nèi)HBV ccc DNA、rc DNA及血清HBV DNA的變異株和野生株比例不一致。85號(hào)標(biāo)本的克隆分析提示此HBV病毒株存在較多無(wú)義突變,但不影響HBV基因表達(dá)。
【學(xué)位單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2011
【中圖分類(lèi)】：R512.62
【部分圖文】：

第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文探針S體系）和HBVccc DNA的定量體系（HF/HR/TaqMan探針H體系）進(jìn)行擴(kuò)增，獲得的HBV DNA和HBV ccc DNA實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線（界面如圖2-1、圖2-2所示），并通過(guò)PCR儀器自帶軟件構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖2-2 HBV cccDNA實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線界面圖中的縱坐標(biāo)為熒光信號(hào)強(qiáng)度Rn，橫坐標(biāo)為擴(kuò)增循環(huán)數(shù)從左至右的指數(shù)曲線依次對(duì)應(yīng)1×109~1×103拷貝/ml 的定量標(biāo)準(zhǔn)品，A圖中縱坐標(biāo)0.16 、B圖中縱坐標(biāo)0.07對(duì)應(yīng)的橫線為設(shè)定的閾值線，閾值和擴(kuò)增曲線的交匯點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)即為Ct值，與模板濃度對(duì)數(shù)呈負(fù)線性相關(guān)。- 18 -

乙型肝炎病毒共價(jià)閉合環(huán)狀 DNA 耐藥相關(guān)位點(diǎn)自然變異的檢測(cè)及結(jié) 果一、DNA測(cè)序結(jié)果在85例患者中，HBV cccDNA 耐藥相關(guān)位點(diǎn)變異陽(yáng)性兩例(2.4%)：204位點(diǎn)變一例（44號(hào)標(biāo)本，見(jiàn)后圖3），214位點(diǎn)變異一例（49號(hào)標(biāo)本，見(jiàn)后圖4）。另有一測(cè)序圖譜顯示雜峰（85號(hào)標(biāo)本，見(jiàn)后圖5）。且相應(yīng)的血清及肝組織HBV DNA中也發(fā)現(xiàn)同樣變異。二、 巢式 PCR 產(chǎn)物的電泳結(jié)果因樣本較多，僅取變異標(biāo)本（編號(hào) 44/49/85）為代表。HBV ccc DNA 電泳如6-1；HBV rc DNA 電泳如圖 6-2。M 為 DNA Ladder；（+）為陽(yáng)性對(duì)照；（—）為性對(duì)照。
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 趙克開(kāi),繆曉輝,徐文勝;HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)乙型肝炎病毒cccDNA的定量檢測(cè)[J];中華傳染病雜志;2005年01期

2 Cha-Ze Lee;Hsuan-Shu Lee;Guan-Tarn Huang;Jin-Chuan Sheu;;Detection of YMDD mutation using mutant-specific primers in chronic hepatitis B patients before and after lamivudine treatment[J];World Journal of Gastroenterology;2006年33期

3 Dieter Glebe;;Recent advances in hepatitis B virus research:A German point of view[J];World Journal of Gastroenterology;2007年01期

本文編號(hào)：2887295