研究目的IL-37是IL-1家族的新成員,在2000年首次被發(fā)現(xiàn)。與IL-1家族其他成員的促炎作用不同,IL-37發(fā)揮抑炎的作用。IL-37的編碼基因位于人2號染色體長臂IL-1家族的基因簇區(qū)內(nèi),有6個外顯子,其中外顯子4、5、6編碼12個β螺旋,組成IL-1家族特有的β三葉草結(jié)構(gòu),是IL-37發(fā)揮生物學(xué)功能所必需的。根據(jù)組成的外顯子不同,IL-37分為a、b、c、d、e五種亞型,其中IL-37b由外顯子1、2、4、5、6組成,是最長且具有功能的亞型;IL-37d由外顯子1、4、5、6組成,僅比IL-37b少了2號外顯子。目前的研究主要集中在IL-37b,對IL-37d的研究尚少。我們實驗室利用自己制備的IL-37d轉(zhuǎn)基因小鼠,在國際上首先證明IL-37d是有功能的亞型,IL-37d同IL-37b 一樣具有抗炎的作用,但其作用的分子通路不完全相同,具有獨特性。然而,IL-37d的其他功能和具體的作用機制尚不清楚。有報道通過蛋白芯片檢測發(fā)現(xiàn)過表達IL-37b可以使雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的磷酸化水平降低,提示IL-37具有抑制mTOR活性的作用,但IL-37b對mTOR的具體作用機制和功能意義尚不清楚。mTOR屬于PI3K相關(guān)蛋白激酶(PIKK)家族,是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,mTOR作為催化亞基以兩種不同的復(fù)合體的形式存在—mTORC1和mTORC2,其中mTORC1的作用更加廣泛并受到廣泛關(guān)注。由于mTOR信號通路能感知能量、營養(yǎng)、壓力和生長因子等信號,在細(xì)胞的生長和代謝等多個過程中發(fā)揮重要作用,提示IL-37除了抑炎作用外,在細(xì)胞生長和代謝中也發(fā)揮作用。那么,IL-37d是否具有調(diào)控mTORC1信號通路的作用?其調(diào)控機制如何?在細(xì)胞代謝(特別是脂質(zhì)代謝)中的作用如何?都是值得探索的科學(xué)問題。本論文的研究目的包括以下三個方面:1.以mTORC1為切入點,確定IL-37d對mTOR信號通路的調(diào)控作用;2.探索IL-37d調(diào)控mTORC1信號通路的具體分子機制;3.利用IL-37d轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建肝臟脂質(zhì)積累模型,在體內(nèi)研究IL-37d對mTORC1信號通路的調(diào)控及對肝臟脂質(zhì)積累的影響。進一步揭示IL-37的功能和機制并為將來IL-37的臨床應(yīng)用提供新的實驗依據(jù)。研究方法一、IL-37d抑制mTORC1信號通路1.用IL-37d或?qū)φ章《靖腥続549細(xì)胞,通過流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測細(xì)胞大小。2.用IL-37d或?qū)φ章《靖腥続549細(xì)胞,通過流式細(xì)胞術(shù)和Western-blot的方法在基礎(chǔ)狀態(tài)、饑餓狀態(tài)、饑餓再活化狀態(tài)下檢測mTORC1信號通路下游分子S6的磷酸化情況。3.用IL-37d或?qū)φ章《靖腥続549細(xì)胞,通過不同的饑餓方式再活化后,用Western-blot的方法檢測p-S6的表達情況,分別是無FBS培養(yǎng)基、無FBS無谷氨酰胺培養(yǎng)基、HBSS饑餓,然后用含10%FBS的培養(yǎng)基活化。4.在HepG2細(xì)胞中沉默IL-37,通過免疫熒光的方法檢測p-S6的表達情況。5.在HepG2細(xì)胞中沉默IL-37,通過Western-blot的方法在基礎(chǔ)狀態(tài)、饑餓狀態(tài)、饑餓再活化狀態(tài)下檢測mTORC1信號通路下游分子S6、4eBP1的磷酸化情況。二、IL-37d調(diào)控mTORC1信號通路的分子機制1.通過免疫共沉淀的方法探究IL-37d與Rheb是否結(jié)合。2.通過免疫熒光的方法驗證IL-37d與Rheb是否有共定位現(xiàn)象。3.用IL-37d或?qū)φ章《靖腥続549細(xì)胞,通過免疫熒光的方法檢測GTP形式的Rheb的表達。4.在HEK-293T細(xì)胞中分別過表達不同濃度的IL-37d質(zhì)粒,通過免疫共沉淀的方法檢測外源性Rheb與內(nèi)源性mTOR的結(jié)合。5.在基礎(chǔ)狀態(tài),共同過表達IL-37d和Rheb兩種質(zhì)粒,通過流式細(xì)胞術(shù)和Western-blot的方法檢測p-S6的表達情況。6.共轉(zhuǎn)染IL-37d和活性Rheb兩種質(zhì)粒,無FBS無精氨酸無亮氨酸的培養(yǎng)基饑餓2小時,通過流式細(xì)胞術(shù)和Western-blot的方法檢測p-S6的表達情況。7.共轉(zhuǎn)染IL-37d和活性Rheb兩種質(zhì)粒,EBSS饑餓2小時,通過流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測p-S6的表達情況。三、IL-37d抑制mTORC1信號通路介導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)積累(一)IL-37d抑制高脂飲食誘導(dǎo)的mTORC1信號通路的活化及肝臟脂質(zhì)積累高脂誘導(dǎo)的肥胖模型,選擇6～8周的雄性IL-37d轉(zhuǎn)基因和WT小鼠進行高脂飲食(60%脂肪),18周后對小鼠解剖。1.統(tǒng)計小鼠體重和肝重。2.取小鼠肝臟組織切片,進行HE染色觀察組織細(xì)胞形態(tài)。3.取小鼠肝臟組織切片,進行免疫組化染色,檢測p-S6的表達。4.提取小鼠肝臟組織蛋白,Western-blot檢測p-S6的表達。5.取小鼠肝臟組織勻漿,檢測小鼠肝臟中的甘油三酯(TG)含量、總膽固醇(TC)含量、游離脂肪酸(FFA)含量。(二)IL-37d抑制禁食16小時誘導(dǎo)的mTORC1信號通路的活化及肝臟短期脂質(zhì)積累禁食16小時模型,選擇6～8周的雄性IL-37d轉(zhuǎn)基因和WT小鼠進行禁食,16個小時后立即對小鼠進行解剖。1.統(tǒng)計小鼠體重和肝重。2.取小鼠肝臟組織切片,進行HE染色觀察組織細(xì)胞形態(tài).3.取小鼠肝臟組織切片,進行免疫組化染色,檢測p-S6的表達。4.提取小鼠肝臟組織蛋白,Western-blot檢測p-S6的表達。。5.取小鼠肝臟組織勻漿,檢測小鼠肝臟中的甘油三酯(TG)含量、總膽固醇(TC)含量、游離脂肪酸(FFA)含量。結(jié)果一、IL-37d抑制mTORC1信號通路(一)IL-37d抑制細(xì)胞大小已知mTORC1信號通路控制細(xì)胞生長和細(xì)胞大小,為了探索IL-37d對mTORC1信號通路的影響,我們首先檢測了過表達IL-37d對細(xì)胞大小的影響。在A549細(xì)胞中,分別感染IL-37d和對照慢病毒,通過流式細(xì)胞術(shù)分別檢測了基礎(chǔ)狀態(tài)、饑餓狀態(tài)、饑餓再活化狀態(tài)細(xì)胞大小的改變,發(fā)現(xiàn)在基礎(chǔ)狀態(tài)和饑餓再活化狀態(tài),感染了 IL-37d慢病毒的這一組較NC組細(xì)胞大小減小,在饑餓再活化狀態(tài)下更為明顯,證明IL-37d抑制細(xì)胞大小并提示IL-37d可能抑制mTORC1信號通路的活化。(二)過表達IL-37d抑制mTORC1信號通路為了弄清IL-37d對mTORC1信號通路的抑制作用,我們利用過表達體系,采用流式細(xì)胞術(shù)和Western-blot的方法檢測了 IL-37d的過表達對mTORC1下游效應(yīng)分子S6的磷酸化影響。流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果顯示感染IL-37d慢病毒的細(xì)胞在基礎(chǔ)狀態(tài)和饑餓再活化狀態(tài),mTORC1信號通路下游分子S6的磷酸化明顯受到抑制,在饑餓再活化狀態(tài)S6的磷酸化被抑制的現(xiàn)象更加明顯。通過Western-blot的方法檢測得到同樣的結(jié)果。進一步我們比較了三種不同的饑餓方式(無FBS的F12K培養(yǎng)基、無FBS無谷氨酰胺的F12K培養(yǎng)基和HBSS饑餓)再活化(含10%FBS的F12K培養(yǎng)基活化)后IL-37d對mTORC1信號通路的作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-37d均可以抑制p-S6的表達,進而確定過表達IL-37d對mTORC1信號通路的抑制作用。(三)沉默IL-37上調(diào)mTORC1信號通路為了進一步確定IL-37d對mTORC1信號通路活化的抑制效應(yīng),我們在HepG2細(xì)胞中沉默IL-37表達,然后采用Western-blot的和免疫熒光的方法檢測mTORC1通路活性的變化,結(jié)果顯示沉默IL-37可促進mTORC1信號通路的活化,從另一個方面證明內(nèi)源性IL-37對mTORC1信號通路的抑制作用。二、IL-37d調(diào)控mTORC1信號通路的分子機制(一)IL-37d與Rheb結(jié)合已知Ras相關(guān)GTP酶(Rheb)是激活mTORC1的關(guān)鍵分子;我們前期研究發(fā)現(xiàn)IL-37b可結(jié)合Ras家族的另一個成員Racl并抑制其活性,故我們提出假說:IL-37可能通過調(diào)控Rheb進而影響mTORC1活性。為了驗證我們的假說,采用免疫熒光和免疫共沉淀的方法探究IL-37d和Rheb的關(guān)系,免疫熒光的結(jié)果顯示IL-37d與Rheb在細(xì)胞漿內(nèi)有明顯的共定位現(xiàn)象;免疫共沉淀實驗進一步證明IL-37d可以與Rheb結(jié)合。提示IL-37d可通過與Rheb結(jié)合進而調(diào)控mTORC1信號通路。(二)IL-37d抑制Rheb的活性為了研究IL-37d與Rheb結(jié)合后是否影響Rheb的活性,我們采用免疫熒光的方法檢測了過表達IL-37d對Rheb活性形式GTP-Rheb的表達水平的影響,結(jié)果顯示感染了IL-37d慢病毒后,GTP-Rheb的表達較弱,說明IL-37d可以抑制Rheb的活性。(三)IL-37d不能競爭性抑制Rheb和mTOR的結(jié)合為了弄清IL-37d結(jié)合后是否可競爭性抑制Rheb與mTOR的結(jié)合,我們分別過表達不同濃度的IL-37d,采用免疫共沉淀的方法,分析了IL-37d不同表達水平對Rheb與mTOR結(jié)合的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-37d的表達對Rheb與mTOR的結(jié)合量沒有明顯的影響,提示IL-37d不是通過競爭性抑制Rheb和mTOR的結(jié)合而發(fā)揮效應(yīng)的。(四)IL-37d通過抑制Rheb活性進而下調(diào)mTORC1通路為了進一步探究IL-37d是否通過抑制Rheb進而下調(diào)mTORC1信號通路,我們在細(xì)胞中共同表達了IL-37d和Rheb兩種質(zhì)粒,首先在基礎(chǔ)狀態(tài)下,采用Western-blot和流式細(xì)胞術(shù)檢測p-S6的表達情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨過表達Rheb后,p-S6表達上調(diào),說明Rheb的過表達可活化mTORC1通路;但同時過表達IL-37d后,這種抑制作用被逆轉(zhuǎn),說明IL-37可通過抑制Rheb進而下調(diào)mTORC1的通路。為了進一步確定IL-37d的作用,我們共轉(zhuǎn)染IL-37d和活性Rheb兩種質(zhì)粒,用無FBS無精氨酸無亮氨酸的培養(yǎng)基饑餓兩個小時,Western-blot和流式細(xì)胞術(shù)檢測p-S6的表達情況,結(jié)果均顯示IL-37d可以逆轉(zhuǎn)活性Rheb對p-S6的活化。證明IL-37d通過抑制Rheb的活性進而下調(diào)mTORC1信號通路。三、IL-37d抑制mTORC1信號通路介導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)積累已知mTORC1信號通路活化在肝臟脂質(zhì)積累中發(fā)揮促進作用,為了在體內(nèi)研究IL-37d對mTORC1信號通路的影響及在肝臟脂質(zhì)積累中的作用,我們分別利用長期高脂飲食誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)積累模型和饑餓16小時誘導(dǎo)的肝臟短期脂質(zhì)積累模型,對此進行了研究。(一)IL-37d抑制高脂誘導(dǎo)的mTORC1信號通路的活化及肝臟脂質(zhì)積累選擇6～8周的雄性IL-37d轉(zhuǎn)基因和WT小鼠進行高脂飲食,18周后對小鼠解剖。發(fā)現(xiàn)IL-37d轉(zhuǎn)基因小鼠體重和肝重明顯降低。免疫組化和Western-blot檢測均發(fā)現(xiàn)IL-37d轉(zhuǎn)基因組小鼠較WT組小鼠p-S6的表達明顯降低,說明IL-37d抑制高脂誘導(dǎo)的mTORC1信號通路的活化。HE染色和肝內(nèi)脂質(zhì)含量檢測發(fā)現(xiàn)IL-37d轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟細(xì)胞中的脂滴較WT小鼠減小、肝內(nèi)甘油三酯含量明顯降低,說明IL-37d抑制mTORC1信號通路介導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)積累。(二)IL-37d抑制禁食16小時誘導(dǎo)的mTORC1信號通路的活化及肝臟短期脂質(zhì)積累6～8周的雄性IL-37d轉(zhuǎn)基因和WT小鼠,禁食16小時建立肝臟內(nèi)短期的脂質(zhì)積累模型。免疫組化和Western-blot檢測均發(fā)現(xiàn)IL-37d轉(zhuǎn)基因組小鼠較WT組小鼠p-S6的表達明顯降低,說明IL-37d抑制禁食16小時誘導(dǎo)的mTORC1信號通路的活化。肝內(nèi)脂質(zhì)含量檢測發(fā)現(xiàn)IL-37d轉(zhuǎn)基因小鼠比WT小鼠甘油三酯含量較低,說明IL-37d抑制mTORC1信號通路介導(dǎo)的肝臟短期脂質(zhì)積累。結(jié)論1.IL-37d抑制mTORC1信號通路。2.IL-37d通過抑制Rheb的活性下調(diào)mTORC1信號通路。3.IL-37d抑制mTORC1信號通路介導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)積累,緩解由過度脂質(zhì)積累造成的脂肪肝現(xiàn)象。創(chuàng)新性和意義1.提出IL-37d作為一種內(nèi)源性“雷帕霉素”抑制mTORC1通路的新機制:發(fā)現(xiàn)IL-37d可以抑制mTORC1信號通路并證明IL-37d通過抑制Rheb活性下調(diào)mTORC 1信號通路,豐富了人們對IL-37的功能和機制的認(rèn)識以及對調(diào)控mTORC1的機制的理解。2.發(fā)現(xiàn)IL-37除了抗炎作用之外,還參與脂質(zhì)代謝等過程:本課題發(fā)現(xiàn)IL-37可抑制mTORC1信號通路介導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)積累,緩解由過度脂質(zhì)積累造成的脂肪肝現(xiàn)象,為IL-37用于代謝性疾病的治療提供了依據(jù)。局限性1.IL-37d調(diào)控mTORC1信號通路的機制還不夠充分和深入。2.需要探究IL-37d調(diào)控mTORC1信號通路在多種疾病模型中的作用。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R575
【部分圖文】：

圖１人ＩＬ－３７的基因結(jié)構(gòu)??（Ｄｉａｎａ?Ｂｏｒａｓｃｈｉ?ｅｔ?ａｌ．，?Ｅｕｒ?Ｃｙｔｏｋｉｎｅ?Ｎｅｔｗ．?２０１１）??

ＡＭＰＫ??圖２?ＩＬ－３７的作用機制??（Ａｙｏｕｂ?Ａｂｕｌｋｈｉｒ?ｅｔ?ａｌ．，?Ｊ?Ｌｅｕｋｏｃ?Ｂｉｏｌ．?２０１７?）?（?Ｙｕｌａｎ?Ｌｉ，ｅｔ??ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２０１７）?（Ｍｉｎｇｓｈｅｎｇ?Ｚｈａｏ?，ｅｔ?ａｌ．，?Ｃｅｉｌ?Ｄｅａｔｈ?？＆?Ｄｉｓｅａｓｅ．２０１８）??二?ｘ?ＩＬ－３７ｂ?與?ｍＴＯＲ??

、．?ｗ?ｉ圖４?ｍＴＯＲＣｌ下游信號通路??（Ｃｅｌｌ?Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ?Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ?ｄｉａｇｒａｍ）??ｌ的激活??Ｃｌ的激活需要營養(yǎng)物質(zhì)，營養(yǎng)物質(zhì)包括氨基酸（主要是亮氨
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本文編號：2884423