目的研究大鼠肝細(xì)胞及白細(xì)胞介素-10(IL-10)對(duì)原代肝星狀細(xì)胞(HSC)增殖、活化及凋亡的影響,并探討其可能機(jī)制。 方法用RT-巢式PCR方法獲取大鼠IL-10基因的全長(zhǎng)編碼序列,采用分子克隆技術(shù)構(gòu)建其真核表達(dá)載體pcDNA3.0-rIL-10,并進(jìn)行雙酶切法及測(cè)序鑒定。通過有或無去唾液酸糖蛋白受體介導(dǎo)的脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠肝細(xì)胞系BRL,采用RT-PCR及ELISA方法觀察IL-10 mRNA和分泌型IL-10蛋白的表達(dá)情況,用MTT法及流式細(xì)胞分析法檢測(cè)轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的BRL細(xì)胞的增殖、凋亡情況。分別將正常的、轉(zhuǎn)染pcDNA3.0空質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-rIL-10質(zhì)粒的BRL細(xì)胞與原代HSC共培養(yǎng),通過相差顯微鏡下觀察、MTT、原位末端標(biāo)記檢測(cè)(TUNEL)、western blot等方法觀察各組HSC的表型變化、增殖、凋亡、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)及I型前膠原的表達(dá)。用抗體芯片技術(shù)檢測(cè)各組BRL細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子的表達(dá)差異。 結(jié)果成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.0-rIL-10,并轉(zhuǎn)染BRL細(xì)胞,獲得高水平的IL-10表達(dá),而后者抑制了BRL細(xì)胞的凋亡。發(fā)現(xiàn)受體介導(dǎo)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率明顯高于非受體介導(dǎo)的脂質(zhì)體。BRL細(xì)胞顯著促進(jìn)HSC的增殖、凋亡以及α-SMA和I型前膠原的表達(dá),使HSC的脂滴消失加速,收縮性增強(qiáng)。IL-10則抑制HSC的增殖、以及α-SMA和I型前膠原的表達(dá),進(jìn)一步促進(jìn)HSC的凋亡。抗體芯片顯示,BRL細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP-1)等三種細(xì)胞因子顯著上調(diào),轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-rIL-10質(zhì)粒的BRL細(xì)胞較之轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒者IL-10顯著上調(diào),VEGF下調(diào)。 結(jié)論受體介導(dǎo)的脂質(zhì)體對(duì)肝細(xì)胞有較高的轉(zhuǎn)染活性,可能成為IL-10基因治療肝纖維化的有效轉(zhuǎn)染載體。肝細(xì)胞促進(jìn)HSC的增殖與活化,其機(jī)制可能與其表達(dá)VEGF、MCP-1、TIMP-1等細(xì)胞因子有關(guān)。IL-10可抑制HSC的增殖與活化,促進(jìn)HSC凋亡,其機(jī)制除直接作用于HSC,還可能通過抑制肝細(xì)胞表達(dá)VEGF而間接作用。
【學(xué)位單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2008
【中圖分類】：R575.2
【部分圖文】：

見分子量分別為 5000bp 左右和 550bp 左右兩條目的片段，而空質(zhì)粒只有 5000bp左右的一條帶（圖 2）。圖2 重組質(zhì)粒pcDNA3.0-rIL-10經(jīng)Bam HI和Hind III雙酶切鑒定1：1kb DNA Marker 2：pcDNA3.0-rIL-10雙酶切 3：pcDNA3.0空質(zhì)粒對(duì)照

加入 10μl 的 20μg/ mL 碘化丙錠貯存液（終濃度用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。采用卡方檢驗(yàn)分析各組間凋亡率的差異。結(jié) 果et-gal脂質(zhì)體與transfastTM脂質(zhì)體對(duì)BRL細(xì)胞轉(zhuǎn)染T-PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1.5%瓊脂糖凝膠上電泳后，A、B 兩組右見到兩條清淅目的條帶（β-actin 和 rIL-10）。NA 表達(dá)水平較低（遠(yuǎn)低于β-actin），在轉(zhuǎn)染后 2第 8 天表達(dá)消失。而 PEIjet-gal 脂質(zhì)體組 IL-10fastTM脂質(zhì)體組（遠(yuǎn)高于β-actin），在轉(zhuǎn)染結(jié)束即6 d 后才開始下降，仍有較高表達(dá)，如圖 1。

組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后分泌型 IL-10 的表達(dá)染 pcDNA3.0 空質(zhì)粒者幾乎測(cè)不到 IL-10 的表達(dá)；轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒者度的分泌型 IL-10 的表達(dá)，在轉(zhuǎn)染結(jié)束后 2 天達(dá)到高峰（12.78n即迅速下降，第 8 天后保持長(zhǎng)時(shí)間的低水平表達(dá)，如表 1，其表達(dá)表 1 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后 BRL 細(xì)胞分泌型 IL-10 的表達(dá)（pg/ml）天數(shù)1 2 4 8 12 16 20 粒組 4754.5 12778.8 3344.2 218.6 226.9 168.7 106.8 粒組 11.97 16.09 9.49 11.97 21.1 11.14 17.74
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2884331