重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是一種病因復(fù)雜,發(fā)病機(jī)制不明,臨床常見(jiàn)的急腹癥,其病情兇險(xiǎn),預(yù)后不良,治療棘手,并發(fā)癥多,目前病死率仍高達(dá)20-30%,有關(guān)其治療方法的探索一直是研究的熱點(diǎn)。 目前臨床上已有通過(guò)檢測(cè)C反應(yīng)蛋白和降鈣素原等來(lái)判斷SAP炎預(yù)后,但是應(yīng)用價(jià)值非常有限。SAP的一個(gè)重要問(wèn)題是尚沒(méi)有一個(gè)特異的血清學(xué)或者其他指標(biāo)來(lái)診斷和預(yù)測(cè)預(yù)后,進(jìn)而指導(dǎo)治療。 髓樣細(xì)胞表達(dá)的激發(fā)受體(triggering receptor expressed on myeloid cells,TREM)屬免疫球蛋白超家族。TREM-1首次發(fā)現(xiàn)是在2001年,加深了人們對(duì)炎癥反應(yīng)啟動(dòng)和發(fā)展過(guò)程的認(rèn)識(shí)。其主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞、成熟單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等天然免疫反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞,選擇性地表達(dá)于肺泡、腸液及其他體液的吞噬細(xì)胞上。TREM-1在眾多炎癥反應(yīng)參與的疾病(包括感染性和非感染性炎癥反應(yīng)、腫瘤等)中均有表達(dá)。TREM-1能促進(jìn)小鼠促炎因子分泌,誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌中性粒細(xì)胞趨化因子,如IL-8、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1、MCP-3)及巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)蛋白-1α(MIP-1α)。TREM-1的激活能導(dǎo)致中性粒細(xì)胞迅速脫顆粒、呼吸爆發(fā)及吞噬作用。Toll樣受體(TLR)-2或TLR-4與配體識(shí)別后可激活TREM-1,促進(jìn)大量致炎細(xì)胞因子的釋放,同時(shí)抑制IL-10的釋放。TREM-1與這些下游細(xì)胞因子形成一個(gè)正反饋的自分泌調(diào)節(jié)回路,促使炎癥反應(yīng)增強(qiáng)放大。同時(shí),通過(guò)磷脂酰肌醇-3激酶依賴途徑,激活TLRs可促進(jìn)TREM-1的表達(dá)。TLR可能通過(guò)激活NF-κB,來(lái)調(diào)節(jié)TREM-1的表達(dá)；而TREM-1同樣可以激活多種轉(zhuǎn)錄復(fù)合物,協(xié)同NF-κB促進(jìn)促炎因子基因的轉(zhuǎn)錄。這些研究結(jié)論顯示,TREM-1和TLR共同介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。TREM-1介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大和膿毒癥的發(fā)生中起著關(guān)鍵性的作用。Gibot等人分別構(gòu)建了小鼠膿毒癥模型和Wistar大鼠膿毒癥模型,分別合成了類似小鼠和大鼠TREM-1胞外區(qū)部分合成肽段,在小鼠膿毒性休克模型里,小鼠胞外區(qū)合成肽可以保護(hù)內(nèi)毒素血癥小鼠免于死亡,而在大鼠模型中,利用合成大鼠胞外區(qū)肽段治療,發(fā)現(xiàn)可以改善血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài),減輕乳酸酸中毒癥狀,調(diào)節(jié)TNF-α、IL-1β等促炎因子的釋放,提高生存率。研究結(jié)果顯示,胞外區(qū)肽段可能成為膿毒癥治療的有效靶標(biāo)。 本課題擬通過(guò)小鼠SAP模型,分析TREM-1 mRNA水平的表達(dá)以及使用免疫組化的方法檢測(cè)TREM-1蛋白水平的表達(dá),評(píng)估其在SAP病程中的作用；構(gòu)建小鼠TREM-1-IgG融合蛋白的原核表達(dá)載體,在大腸桿菌中大量表達(dá)并純化出小鼠TREM-1融合蛋白,對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化,取得較高純度蛋白,用于治療小鼠SAP,驗(yàn)證TREM-1作為SAP分子治療靶點(diǎn)的價(jià)值,從而為更深入了解TREM-1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,為明確TREM-1能否作為各種疾病的診斷標(biāo)志和治療靶點(diǎn)提供依據(jù),為探索相關(guān)疾病新的治療方法提供線索。 一、TREM-1在小鼠SAP的表達(dá) 目的：檢測(cè)小鼠SAP胰腺組織TREM-1的表達(dá) 方法：50只雄性昆明小鼠隨機(jī)分為5組,用生理鹽水配置20%L-精氨酸利用腹腔注射的方法,按照4g／kg的劑量,間隔一小時(shí)重復(fù)注射一次,制備SAP模型。對(duì)照組昆明小鼠,腹腔注射生理鹽水,造模后24h,48h,72h,96h分批處死小鼠,心臟采血,同時(shí)留取胰腺,肝臟,肺臟組織。測(cè)定淀粉酶,肌酐和谷丙轉(zhuǎn)氨酶,觀察各組小鼠胰腺等組織病理學(xué)變化并評(píng)分；并以RT-PCR, real-timePCR的方法檢測(cè)外周血白細(xì)胞及胰腺組織TREM-1 mRNA表達(dá)；免疫組化法檢測(cè)小鼠胰腺組織中TREM-1蛋白表達(dá)。 結(jié)果：血清淀粉酶檢測(cè)和組織病理學(xué)結(jié)果,證實(shí)造模成功。各組小鼠按照時(shí)間點(diǎn)處置,無(wú)菌操作下留取胰腺組織,抽提總mRNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增出小鼠TREM-1,擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期目的基因一致,回收純化產(chǎn)物送檢測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與GenBank公布的序列同源性100%。進(jìn)行real-timePCR相對(duì)定量檢測(cè),統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示TREM-1 mRNA表達(dá)量隨著病程進(jìn)展在各組小鼠胰腺組織中發(fā)生變化。免疫組化結(jié)果顯示TREM-1蛋白在SAP小鼠的胰腺組織存在表達(dá)。 結(jié)論：TREM-1的相對(duì)表達(dá)量在SAP小鼠病程中逐漸升高,48h升至頂峰,后逐漸下降,提示TREM-1在SAP的發(fā)生發(fā)展中有一定作用。 二、TREM-1-IgG重組融合蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)、純化和鑒定 目的：構(gòu)建小鼠TREM-1-IgG重組融合蛋白的原核表達(dá)載體,大量表達(dá)融合蛋白,純化后進(jìn)行鑒定。 方法：利用限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)EcoR I, BamH I和Xho I,雙酶切表達(dá)載體pMD18-T; pMD18-T/小鼠TREM-1胞外區(qū)質(zhì)粒經(jīng)EcoRI/BamHI雙酶切；pMD18-T/人IgG-Fc質(zhì)粒經(jīng)BamH I/Xho I雙酶切；酶切后的三片段由T4DNA ligase連接,連接產(chǎn)物應(yīng)用CaCl2法轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞,抽提鑒定重組質(zhì)粒pGEX4T-1/小鼠TREM1-IgG。選擇自構(gòu)建載體pet-28a-His-sumo為表達(dá)載體,從pGEX4T-1/小鼠TREM-1-IgG質(zhì)粒上PCR擴(kuò)增目的片段,BglⅡ/XhoⅠ雙酶切后的片段接入到pet28a-His-sumo,構(gòu)建表達(dá)重組蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒pet28a/小鼠TREM-1-IgG。經(jīng)測(cè)序鑒定無(wú)誤。陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)入BL21以后,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白,同時(shí)優(yōu)化表達(dá)條件,使用His-affinity-resin層析柱純化；初步純化后的融合蛋白為小鼠TREM-1-IgG(含載體上SUMO蛋白),應(yīng)用SUMO蛋白酶酶切去除SUMO。純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE及Western-Blot來(lái)鑒定表達(dá)產(chǎn)物。 結(jié)果：重組質(zhì)粒pGEX4T-1/小鼠TREM1-IgG原核表達(dá)載體構(gòu)建后,經(jīng)轉(zhuǎn)化入E.coli DH5a后質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,RT-PCR擴(kuò)增后行酶切,獲得原質(zhì)粒和目的基因的兩條特異性條帶,并經(jīng)測(cè)序鑒定。SDS-PAG及Western-Blot分析證實(shí)表達(dá)產(chǎn)物為T(mén)REM-1融合蛋白。更換載體進(jìn)行蛋白優(yōu)化,使用SUMO蛋白酶將初步純化后的表達(dá)產(chǎn)物去除SUMO,獲得純化后TREM-1融合蛋白,行SDS-PAGE和Western Blot檢測(cè),證實(shí)為目的蛋白。 結(jié)論：成功構(gòu)建了小鼠TREM-1重組融合蛋白的原核表達(dá)載體,對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行蛋白優(yōu)化過(guò)程,通過(guò)SAS-PAGE和Western-Blot檢測(cè),證實(shí)為目的蛋白。 三、TREM-1融合蛋白對(duì)SAP小鼠的治療作用 目的：觀察TREM-1融合蛋白對(duì)SAP小鼠的治療作用 方法：70只昆明種小鼠,每只經(jīng)腹腔注射精氨酸構(gòu)建SAP模型后,隨機(jī)將其分為7組,一組和二組為T(mén)REM-1融合蛋白治療組,造模后6小時(shí)經(jīng)尾靜脈注射TREM-1融合蛋白,給藥濃度為8mg/kg,三組和四組為陽(yáng)性對(duì)照組,七組為陰性對(duì)照組。采用目前臨床上治療SAP的藥物烏司他丁,給藥濃度為10萬(wàn)U／kg,五組和六組為SAP對(duì)照組,以生理鹽水靜脈注射。一、三、五組分別在造模后24h處死,二、四、六組分別在造模后72h處死。檢測(cè)外周血中炎癥因子的表達(dá),病理分析胰腺和肺臟的損傷情況,評(píng)估TREM-1重組融合蛋白的治療作用。同時(shí)免疫組化半定量觀察療效。 結(jié)果：TREM-1融合蛋白治療組可顯著提高生存率(P0.05)；病理學(xué)結(jié)果示TREM-1融合蛋白治療組較SAP對(duì)照組在胰腺及肺臟的水腫出血,炎癥,壞死明顯減輕(P0.05)；血清中炎癥因子(sTREM-1, MIP-1α和超敏CRP)含量顯著低于SAP對(duì)照組(P0.05)；免疫組化結(jié)果證實(shí)TREM-1融合蛋白24h治療組的胰腺及肺臟組織中NF-KB陽(yáng)性率及染色強(qiáng)度較SAP對(duì)照組顯著降低(P0.05)；與烏司他丁治療組療效相當(dāng)(P0.05)。 結(jié)論：TREM-1重組融合蛋白能有效緩解SAP小鼠的炎癥反應(yīng),減輕胰腺、肺臟組織損害,降低血清中炎性因子含量。 通過(guò)上述研究,本課題得出以下結(jié)論： 1、TREM-1參與了SAP發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的炎癥反應(yīng),外周血TREM-1含量在SAP小鼠病程中逐漸升高,48h升至頂峰,后逐漸下降。 2、成功構(gòu)建了小鼠TREM-1融合蛋白的原核表達(dá)載體,大量表達(dá)并純化出小鼠TREM-1重組融合蛋白；并經(jīng)鑒定證實(shí)為目的蛋白。 3、TREM-1融合蛋白能有效緩解SAP小鼠的炎癥反應(yīng),減輕胰腺、肺臟組織損害,提高生存率,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)TREM-1作為分子治療靶點(diǎn)可能是SAP治療的一個(gè)新選擇。 小結(jié)：本研究通過(guò)動(dòng)物模型初步證實(shí)TREM-1在SAP小鼠中表達(dá),同時(shí)構(gòu)建載體,表達(dá)并純化獲得小鼠TREM-1重組融合蛋白,觀察TREM-1重組融合蛋白對(duì)SAP小鼠的治療作用,通過(guò)ELISA方法檢測(cè)血清中TREM-1,CRP, IL-1β,MIP-1α等炎癥因子,以及組織病理變化來(lái)觀察療效,了解TREM-1與各種炎癥因子的相互作用,初步證實(shí)了TREM-1作為小鼠SAP分子治療靶點(diǎn)的價(jià)值。為SAP患者外周血sTREM-1含量檢測(cè)在臨床的應(yīng)用和后續(xù)尋找鑒定TREM-1的天然配體奠定了基礎(chǔ)。為SAP發(fā)病機(jī)制的探討和分子靶向治療提供新的思路。
【學(xué)位單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2010
【中圖分類】：R576
【部分圖文】：

血清谷內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶的檢測(cè)結(jié)果

4h胰腺(xzoos

第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文大量中性粒細(xì)胞。48h、72h、96h出血明顯，肺泡間質(zhì)明顯增寬，大部分肺泡和間質(zhì)有中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，結(jié)構(gòu)損害較重。(圖1一12)顯微鏡下觀察肝臟:出血、炎癥、壞死不明顯，各組之間無(wú)明顯差別。圖(l一13)對(duì)各組病理變化按照方法中的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理評(píng)分，利用SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組胰腺組織隨著病程進(jìn)展，炎癥壞死加重(P<0.05)。
【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 凌穎;SAP合并急性肺損傷的機(jī)制及地塞米松的防治作用研究[D];川北醫(yī)學(xué)院;2012年

本文編號(hào)：2871916