內臟痛是許多胃腸道疾病最常見的癥狀之一,但其發(fā)生機制還不清楚。目前認為,內臟異常疼痛的產生主要歸結為外周敏感化和中樞敏感化。各種原因引起的內臟組織和初級傳入神經元的敏感化可以誘導和易化中樞敏感化,所以了解初級神經元敏感化的機制,探索降低其興奮性的方法對干預痛覺信號的傳導、控制疼痛具有重要意義。 內臟感覺主要通過結狀神經節(jié)與脊髓背根神經節(jié)(dorsal root ganglia,DRG)傳入到次級感覺神經元,其中一般的內臟感覺主要通過結狀神經節(jié)傳導,而痛覺主要通過DRG神經元傳導。按其直徑不同,DRG神經元可以分為大型神經元(39-50μm)、中型神經元(33-38μm)和小型神經元(19-27μm)三類。其中,中、小型神經元主要發(fā)出細髓的Aδ纖維和無髓的C類纖維,傳遞傷害性感覺,與痛覺產生密切相關。因此,DRG中的中小神經元是內臟痛覺信號傳導與調控的初級靶點。 電壓依賴性鈉通道決定神經細胞動作電位的產生和傳導,它的改變對于神經元的興奮性具有重要的影響。鈉通道由一個α亞單位和兩個β亞單位組成。目前已經克隆出九種α亞單位,并據此將電壓依賴性鈉通道分為9種類型,即Nav1.1-Nav1.9。根據其對河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)的敏感性又可分為河豚毒素敏感(TTX-sensitive,TTX-S)和河豚毒素不敏感(TTX-resistant,TTX-R)兩種類型。其中,Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.6和Nav1.7屬于TTX-S鈉通道,而Nav1.5,Nav1.8和Nav1.9屬于TTX-R鈉通道。Nav1.3、Nav1.7、Nav1.8和Nav1.9參與痛覺信號的調控。一些誘發(fā)疼痛的病理性因素影響DRG細胞中鈉通道的表達和功能,改變DRG細胞的興奮性。 BDNF(brain-derived neurotrophic factor)是一種神經營養(yǎng)因子,廣泛存在于中樞與外周神經系統(tǒng)中。以往的研究認為,BDNF的主要作用是調節(jié)突觸的可塑性和神經遞質的釋放,參與學習和記憶過程。但近來越來越多研究發(fā)現,BDNF也參與對痛覺傳導的調控。在脊髓中,BDNF由DRG細胞合成后被運輸到中樞端,在脊髓后角釋放,與第二級感覺神經元上的Trk B受體結合,調節(jié)突觸傳遞和脊髓痛覺的傳導,導致中樞神經元興奮性的改變。BDNF還可以通過自分泌和旁分泌的方式調節(jié)DRG神經元的興奮性。 腸道益生菌是與人類共生的、具有治療或保健作用的細菌,主要包括乳酸桿菌(Lactobacillus reuteri)和雙歧桿菌。它們能夠調節(jié)炎癥引起的腸道敏感性的改變,調節(jié)腸道內在感覺神經元的興奮性,對一些腸道疾病包括腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)和炎癥性腸道疾病等所引起的腹部不適癥狀具有明顯的改善作用。 由于重復的結直腸擴張刺激(colorectal distention,CRD)能夠誘導內臟高敏感性,本課題研究該模型大鼠DRG神經元興奮性的改變及其機制,探討鈉通道和BDNF在DRG興奮性改變中所起的作用,并進一步研究乳酸桿菌對DRG興奮性改變的調節(jié)作用及其相關機制。本課題將揭示DRG神經元興奮性的改變在內臟高敏感性發(fā)生中的作用,并為尋找新的鎮(zhèn)痛藥物提供依據。 [研究目的] 1探討CRD對大鼠遠端結腸DRG神經元興奮性的影響。 2探討CRD后大鼠DRG神經元電壓依賴性鈉通道表達和功能是否發(fā)生改變。 3研究CRD對大鼠DRG神經元BDNF表達的影響及外源性BDNF在CRD致大鼠DRG神經元敏感化過程中所起的作用。 4探討乳酸桿菌對CRD后大鼠DRG神經元敏感性的影響及其機制。 [研究方法和結果] 1結直腸擴張內臟痛模型的建立 1.1 DRG神經元的逆行標記 健康雄性SD大鼠,腹腔注射麻醉,打開腹腔,找到結腸遠端,向結腸壁注射1,1-dioctadecyl-3-3-3-3-tetramethylindocarbocyanine(DiI,5mg/ml),注射6到10個點(1.0μl/injection),縫合腹壁。 1.2 CRD內臟痛模型的建立 注射DiI兩周后,大鼠腹腔內注射氯胺酮(75mg/kg)與甲苯噻嗪(10mg/kg)麻醉,利用Barostat system(Distender,G J Electronic Inc)給予1小時重復的CRD刺激(80 mm Hg,30s on,30 s off),對照組只給予氯胺酮與甲苯噻嗪腹腔注射麻醉,不給予CRD刺激。 2擴張腸段MPO活性檢測 大鼠處死后,取擴張的遠端結腸段,根據試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書檢測單位結腸重量中MPO的活性。結果顯示,同no CRD組相比,在分別給予CRD后1h、3h、6h、12h、24h,其MPO活性未見明顯增加。 3 RT-PCR檢測CRD后不同時間段DRG中BDNF mRNA含量的表達 提取DRG中mRNA,檢測發(fā)現在CRD后3h、6h、12h、24h,DRG中的BDNF mRNA含量明顯增高。 4 ELISA檢測CRD后不同時間段DRG中BDNF蛋白含量的變化 提取DRG中蛋白,檢測發(fā)現同正常DRG相比,CRD后1h、3h、6h、12h、24h,DRG中BDNF蛋白含量明顯增高。 5 DRG細胞的培養(yǎng) 給予CRD刺激之后,立刻頸椎脫臼犧牲大鼠,取出腰骶段脊柱,取出兩邊的DRG;置于Krebs溶液中;加入膠原酶Ⅰ(1mg/ml)和胰酶(0.25%),37℃消化50min,接種于包被了PLL的35mm培養(yǎng)皿中,37℃,5%CO_2,95%O_2培養(yǎng)過夜。 6膜片鉗記錄 6.1 CRD細胞自發(fā)放電 在電流鉗模式下,I=0,記錄細胞自發(fā)放電的情況。結果發(fā)現,no CRD組,自發(fā)放電的細胞占7.3%;CRD組自發(fā)放電細胞數量有所增加占9.4%,兩者未見顯著性差異。 6.2 CRD刺激之后動作電位的產生和各項指標的檢測 記錄刺激動作電位產生所需要的基強度和2倍、3倍基強度刺激產生動作電位的數量。結果顯示,在給予1h重復CRD刺激后,DRG神經元產生動作電位基強度降低,2倍、3倍基強度刺激誘發(fā)DRG神經元產生動作電位的數量增多,說明CRD后DRG神經元的興奮性明顯增高。 6.3 CRD對大鼠DRG神經元鈉電流的影響 電極電阻控制在2-4 MΩ,所有的鈉電流在細胞成為全細胞之后5分鐘進行記錄,串聯電阻被補償85-90%。分別記錄no CRD組和CRD組大鼠DRG細胞鈉通道的激活、失活及復活電流的變化。結果發(fā)現,在CRD后,大鼠DRG細胞上TTX-S和slow TTX-R鈉通道的激活和復活過程沒有發(fā)生明顯的改變,而其失活曲線向去極化方向移動,表明其失活電壓依賴性發(fā)生改變。 6.4 BDNF對正常及CRD大鼠DRG神經元興奮性的影響 研究發(fā)現,no CRD組在加入5ng/ml BDNF 5min后,DRG動作電位閾值及動作電位的產生頻率都未見變化,而幅值、去極化的速率明顯下降;在CRD組中神經元加入同樣劑量的BDNF后,DRG神經元動作電位的閾值明顯升高,給予3倍基強度刺激誘發(fā)DRG神經元產生動作電位的數量減少。說明BDNF下調CRD后DRG神經元的敏感性。 6.5乳酸桿菌對正常及CRD大鼠DRG神經元敏感性的影響。 用乳酸桿菌(5×10~9CFU/ml)連續(xù)灌胃對正常大鼠DRG神經元的電生理特性沒有影響,但明顯升高CRD后DRG神經元動作電位產生的基強度,降低動作電位的去極化速率及產生頻率,說明乳酸桿菌下調CRD后DRG神經元的興奮性。 [結論] 1遠端結腸受到80mmHg的CRD刺激1h后,可以引起相應節(jié)段DRG細胞興奮性明顯增加。 2 CRD后DRG神經元電壓依賴性鈉通道失活動力學發(fā)生改變,這可能是CRD導致DRG細胞高敏感性的發(fā)生的原因之一。 3內源性BDNF可能下調CRD后DRG神經元的興奮性。 4乳酸桿菌抑制CRD引起的DRG神經元的敏感化,對內臟痛具有潛在的治療作用。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2009
【中圖分類】：R57
【部分圖文】：

1.1DII標記的DRG神經元，在熒光顯微鏡下呈現桔紅色熒:倒置顯微鏡下細胞形態(tài):圖A中細胞所發(fā)出的熒光:倒置顯微鏡下，圖A中箭頭所指的細胞的形態(tài):圖C中細胞所發(fā)出的熒光igure1.1DII一labeledneurons，TheisolatedDRGneuronthateulturedovernight.，AftertemPeraryUVillumination，eellsinfig.Aemitsorange一redfluoreseenee.，Theshapeoftheneuroninfig.Amarkedbyarrow.，AftertemPeraryUVillumination，thecellinfig.Cemitsorange一redfluoreseenee，

圖1.2:遠端結腸中MPO活性Figurel.2TheMPOaetivityindistaleolonRG細胞數量的變化RD刺激組大鼠的DRG神經元都可以見到少量的自發(fā)放細胞，其中有6個自發(fā)放電(7.3%);CRD組記錄64個電(9.4%)，經卡方檢驗，二者未見顯著性差異。DR圖1.3。DRG中感覺神經元的靜息電位為一54.53士1.01mV;CR2mV，兩者未見顯著性差異(圖1.4)。

對照組記錄82個細胞，其中有6個自發(fā)放電(7.3%);CRD組記錄64個細胞，其中有6個自發(fā)放電(9.4%)，經卡方檢驗，二者未見顯著性差異。DRG中神經元典型自發(fā)放電見圖1.3。對照組大鼠DRG中感覺神經元的靜息電位為一54.53士 1.01mV;CRD組靜息電位為一53.巧士1.22mV，兩者未見顯著性差異(圖1.4)。
【引證文獻】

相關期刊論文 前1條

1 姜彬言;王巧民;;益生菌治療腸易激綜合征的相關機制[J];醫(yī)學綜述;2011年15期

相關碩士學位論文 前1條

1 姜彬言;益生菌治療對IBS患者腸道菌群、心理狀況、生活質量及癥狀的影響[D];安徽醫(yī)科大學;2012年

本文編號：2867160