發(fā)布時(shí)間：2020-10-30 15:05

　　 克羅恩病是一種慢性反復(fù)發(fā)作性腸道疾病,主要累及小腸末端和結(jié)腸起始部。腸道穿透性病變是克羅恩病常見的外科并發(fā)癥,且病程嚴(yán)重復(fù)雜。然而,關(guān)于克羅恩病合并穿透性病變的研究多集中于克羅恩病合并肛周穿透性病變,較少涉及腸道穿透性病變。目前克羅恩病的病因尚不明確,主流觀點(diǎn)認(rèn)為克羅恩病是由遺傳變異、腸道菌群、宿主免疫系統(tǒng)和環(huán)境因素等多重因素的復(fù)雜相互作用引起。而表觀遺傳學(xué)作為連接遺傳因素與非遺傳因素的重要環(huán)節(jié),在克羅恩病的發(fā)病中勢必起到重要作用。同時(shí),克羅恩病穿透性腸黏膜病變的病因也尚不明確,普遍觀點(diǎn)認(rèn)為,這是感染或膿毒癥引起的急性炎癥的慢性結(jié)果,與深部黏膜潰瘍的形成有關(guān)。但其中的具體機(jī)制與參與因素亦尚不明確。DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)中研究最為廣泛的一個(gè)分支,或許可以從機(jī)制上解釋這一復(fù)雜病變的產(chǎn)生。DNA甲基化是在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的催化下,將一個(gè)甲基共價(jià)連接到胞嘧啶的5號碳原子上,形成5-甲基胞嘧啶。早期研究多關(guān)注克羅恩病外周血的DNA甲基化變化,僅有少量研究關(guān)注克羅恩病中的腸黏膜組織。而腸黏膜組織是人體內(nèi)環(huán)境與外界環(huán)境和腸道菌群最直接的交流部位,且包含豐富復(fù)雜的腸道免疫系統(tǒng),因此,克羅恩病腸黏膜組織的DNA甲基化狀態(tài)更值得深究,同時(shí)或許可以為腸黏膜穿透性病變的機(jī)制探索提供新的思路。第一部分合并有腸道穿透性病變的克羅恩病的臨床特征目的:本部分研究旨在通過分別對合并有腸道穿透性病變的克羅恩病與既無狹窄又無穿透性病變和單純狹窄性病變的患者進(jìn)行比較,分析該類患者的特殊臨床特征。方法:回顧性地收集2010年9月至2014年8月南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院普通外科收治的確診克羅恩病患者共343名。根據(jù)蒙特利爾分類標(biāo)準(zhǔn),將患者分為3組:腸道穿透性病變組(B3型),腸道狹窄性病變組(B2型)以及無腸道穿透性及狹窄病變組(B1和P型)。比較組間的人口學(xué)資料與臨床相關(guān)數(shù)據(jù)。結(jié)果:腸道穿透性病變組患者接受腸道手術(shù)的比例顯著高于腸道狹窄性病變組(82.2%vs.67.4%,P=0.015)和無腸道穿透性及狹窄病變組(82.2%vs.58.1%,P=0.000)。其中,腸道穿透性病變組患者接受回腸切除術(shù)的比例分別顯著高于其余兩組(43.3%vs.14.0%,P=0.000,43.3%vs.9.7%,P=0.019)。腸道穿透性病變組患者接受其他小腸切除手術(shù)(34.4%vs.20.2%,P=0.019)和回腸造口術(shù)(11.1%vs.1.6%,P=0.005)的比例顯著高于無腸道穿透性及狹窄病變組。結(jié)論:合并有腸道穿透性病變的克羅恩病患者相較于其他類型的克羅恩病患者的腸道手術(shù)率明顯升高。第二部分克羅恩病穿透性腸黏膜病變的差異DNA甲基化位點(diǎn)初篩目的:本研究的目的是利用最新的Infinium 850K DNA甲基化芯片,全面評估從成人克羅恩病患者的腸黏膜組織中全基因組DNA的甲基化改變,并與健康人的腸黏膜組織中DNA甲基化狀態(tài)比較,篩選差異性DNA甲基化位點(diǎn)。方法:隨機(jī)選擇2016年11月在南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院接受腸鏡檢查的克羅恩病患者7名。以年齡、性別為標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格匹配7名健康人作為對照組。在克羅恩病患者穿透性病變部位和鏡下正常部位分別取腸黏膜組織,為克羅恩病穿透組和克羅恩病非穿透組;健康人的腸黏膜組織則進(jìn)入正常組。利用Infinium 850K DNA甲基化芯片分析甲基化異常位點(diǎn)。結(jié)果:比較克羅恩病穿透性腸黏膜組織與正常腸黏膜組織,共篩選出5200個(gè)差異性DNA甲基化位點(diǎn)。差異程度最大的位點(diǎn)包括:超甲基化位點(diǎn)(KCNJ13;GIGYF2,C7orf72 和 HLA-DRB1),去甲基化位點(diǎn)(HERPUD2,MUC1和TMTC2)。比較克羅恩病穿透性腸黏膜組織與非穿透性腸黏膜組織,共篩選出3237個(gè)差異性DNA甲基化位點(diǎn)。差異程度最大的位點(diǎn)包括:超甲基化位點(diǎn)(MTSS1,YPEL5,EFCAB11 和 CBLB),去甲基化位點(diǎn)(PLEKHG1,LINC01506和KIAA0753)。差異性DNA甲基化位點(diǎn)參與凋亡的正調(diào)控過程與白介素-8生成的正向調(diào)控過程,并富集于炎癥性腸病相關(guān)的信號通路以及細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用信號通路。結(jié)論:克羅恩病穿透性腸黏膜病變相關(guān)的DNA甲基化差異位點(diǎn)有C7orf72,HLA-DRB1,MUC1,YPEL5,CBLB等。凋亡過程,IL-8的生成以及ECM異常相關(guān)可能是參與克羅恩病穿透性腸黏膜病變的機(jī)制。第三部分克羅恩病穿透性腸黏膜病變的差異DNA甲基化位點(diǎn)的驗(yàn)證目的:本研究通過焦磷酸測序方法驗(yàn)證Infinium850K　DNA甲基化芯片的結(jié)果,揭示相關(guān)位點(diǎn)甲基化異常在克羅恩病穿透性腸黏膜病變過程中的作用。同時(shí)探究DNA甲基化程度變化與疾病活動(dòng)度之間的關(guān)系。方法:選擇在南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院接受腸鏡檢查的克羅恩病患者25名,健康對照者7名。收集患者的年齡、性別、克羅恩病疾病活動(dòng)度評分等資料。分別在克羅恩病患者和健康者的腸黏膜穿透性病變部位取腸黏膜組織。利用焦磷酸測序方法檢測HLA-DRB1、MUC1、YPEL5和CBLB位點(diǎn)的甲基化異常程度。結(jié)果:克羅恩病組的腸黏膜組織相較于對照組,HLA-DRB1、YPEL5和CBLB位點(diǎn)的甲基化程度均顯著升高,而MUC1位點(diǎn)的甲基化程度則顯著降低�？肆_恩病組的HLA-DRB1、YPEL5和CBLB基因的相對表達(dá)量均顯著降低,MUC1基因的相對表達(dá)量則顯著升高。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),4個(gè)位點(diǎn)HLA-DRBB1(r =-0.62,P0.001),MUC1(r =-0.45,P = 0.01),YPEL5(r =-0.55,P = 0.001)以及CBLB(r =-0.62,P0.001)的甲基化異常程度均與其相對表達(dá)量均成顯著負(fù)相關(guān)。MUC1的甲基化異常程度與克羅恩病疾病活動(dòng)度評分呈顯著負(fù)相關(guān)(r =-0.50,P = 0.01)。結(jié)論:克羅恩病穿透性腸黏膜病變組織中發(fā)現(xiàn)HLA-DRB1、YPEL5和CBLB的甲基化程度異常升高,而MUC1的甲基化程度降低。MUC1的甲基化異常程度與克羅恩病疾病活動(dòng)度呈負(fù)相關(guān)。
【學(xué)位單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R574.62
【部分圖文】：

二、ＤＮＡ的鑒定??應(yīng)用基因組試劑盒純化獲得２１個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對照組樣本的ＤＮＡ樣品，通過??電泳檢測，樣品ＤＮＡ條帶均清晰，無雜帶及拖帶（如圖２．１所示）。且ＯＤ２６０／２８０??比值在１．７０－１．９０之間（見表２．３），說明ＤＮＡ純度較髙。ＤＮＡ樣品提取量充足。??圖２．１?ＣＤ組與對照組樣品ＤＮＡ純化電泳圖??注：最后一列為?ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ，從上到下依次為?２０００ｂｐ、ｌＯＯＯｂｐ、７５０ｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、??ｌＯＯｂｐ。??４７??

四、ＣＤ穿透性、非穿透性腸黏膜組織與正常腸黏膜組織之間的ＤＮＡ甲基化差??異??（一）總體結(jié)果??１．?ＣＤ穿透性腸黏膜組織與正常腸黏膜組織比較??共篩選出５２００個(gè)差異性ＤＮＡ甲基化位點(diǎn)。其中超甲基化位點(diǎn)２９７８個(gè)，去??甲基化位點(diǎn)２２２２個(gè)。??２．?ＣＤ穿透性腸黏膜組織與非穿透性腸黏膜組織比較??共篩選出３２３７個(gè)差異性ＤＮＡ甲基化位點(diǎn)。其中超甲基化位點(diǎn)１１５７個(gè)，去??甲基化位點(diǎn)２０８０個(gè)。??

通過繪制火山圖（圖２．４），篩選超甲基化與去甲基化程度最高的若干位如下：??超甲基化位點(diǎn)：ＫＣＮＪ１３；ＧＩＧＹＦ２，Ｃ７ｏｒｆ７２?和?ＨＬＡ－ＤＲＢ１??去甲基ｆｔ位點(diǎn)：ＨＥＲＰＵＤ２，ＭＵＣ１?和?ＴＭＴＣ２??５
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本文編號：2862642