研究背景 與人類共生的微生物群落數(shù)量龐大,它們廣泛分布于人體的皮膚、口腔及胃腸道,其中寄生于胃腸道的微生物統(tǒng)稱為腸道菌群,是人體微生態(tài)群落中最復(fù)雜的生物區(qū)。正常成年人腸道菌群重量可達(dá)1-2kg,數(shù)量多達(dá)1014,包含500-1000種不同類型,主要包括厭氧菌、兼性厭氧菌、好氧菌等,各菌群在胃腸道中按一定的比例、數(shù)量呈不同程度分布。它們?cè)谡Ｇ闆r下保持動(dòng)態(tài)平衡,對(duì)宿主維持機(jī)體健康是必需和有益的。正常腸道菌群具有消化營(yíng)養(yǎng)、生物合成、生物屏障及促進(jìn)免疫系統(tǒng)成熟的生理作用。生理情況下,腸道正常菌群與完整的腸黏膜結(jié)構(gòu)、黏膜表面的粘蛋白、分泌型免疫球蛋白A (slgA)、及腸壁免疫細(xì)胞共同構(gòu)成了腸道的黏膜屏障系統(tǒng),阻止了腸道細(xì)菌及細(xì)菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素向腸外移位。但在各種病理狀態(tài)下,維持菌群平衡的宿主條件受到破壞,引起菌群失衡。菌群失衡主要包括菌群比例失調(diào)與細(xì)菌移位兩大類。比例失調(diào)是指腸道內(nèi)的原籍優(yōu)勢(shì)菌生長(zhǎng)受抑制而數(shù)量減少,而正常情況下占少數(shù)的細(xì)菌過(guò)度繁殖,兩者比例失衡,破壞腸道微生態(tài)平衡。細(xì)菌移位(bacterial translocation, BT),是指細(xì)菌與細(xì)菌毒素產(chǎn)物(如內(nèi)毒素)從腸腔進(jìn)入腸系膜淋巴結(jié)(mesenteric lymph nodes, MLN)和其他腸外器官與部位。多數(shù)情況下,內(nèi)毒素血癥是反映細(xì)菌移位的重要指標(biāo)。由此可見(jiàn),腸道是機(jī)體內(nèi)最大的儲(chǔ)菌庫(kù)和內(nèi)毒素池,亦是內(nèi)源性感染和內(nèi)毒素血癥的主要來(lái)源。在某些病理情況下如肝硬化、重型肝炎、嚴(yán)重?zé)齻瓤梢猿霈F(xiàn)腸道微生態(tài)失衡,腸屏障功能損傷,細(xì)菌及內(nèi)毒素移位以及腸源性內(nèi)毒素血癥,嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量。 肝硬化是我國(guó)常見(jiàn)疾病,患者常死于感染、上消化道出血、肝性腦病等嚴(yán)重并發(fā)癥。腸道菌群通過(guò)門靜脈及淋巴系統(tǒng),與肝臟不僅在解剖結(jié)構(gòu)上建立了密切的關(guān)系,在生理功能上也有著緊密聯(lián)系。一方面,腸道菌群可提供維生素K等促進(jìn)肝臟凝血因子的合成,并可提高肝臟枯否細(xì)胞數(shù)量及功能,增強(qiáng)機(jī)體免疫功能；另一方面肝臟分泌的膽汁酸等維持腸道菌群的生態(tài)平衡。既往研究表明腸道菌群失調(diào)是肝硬化患者發(fā)生自發(fā)性腹膜炎、腸源性內(nèi)毒素血癥及肝性腦病等嚴(yán)重并發(fā)癥的重要原因。李蘭娟等通過(guò)宏基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)肝硬化病人糞便細(xì)菌群落與健康人相比具有一定特征性,其糞便中腸桿菌科和鏈球菌科的增加及毛螺菌科的減少可能影響發(fā)病進(jìn)程。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦顯示腸道菌群紊亂在大鼠肝硬化模型并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。但目前對(duì)肝硬化患者腸道菌群的大規(guī)模臨床調(diào)查和研究較少,對(duì)菌群紊亂的具體菌屬尚不完全明確,腸道菌群失衡是否影響患者預(yù)后尚不確切。 研究目的 本研究旨在以健康人為對(duì)照,觀察不同分級(jí)下肝硬化患者腸道菌群及血清內(nèi)毒素改變,并對(duì)腸道菌群失衡與肝硬化分級(jí)及預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行初步探討,為肝硬化患者加強(qiáng)腸道屏障功能以及發(fā)掘新的益生菌制劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料與方法 1、研究對(duì)象 采集2010年9月至2011年9月問(wèn)在廣州南方醫(yī)院住院明確診斷為肝硬化患者的糞便及外周靜脈血液標(biāo)本,另采集健康志愿者的糞便及外周靜脈血液標(biāo)本作為對(duì)照組。肝硬化組納入標(biāo)準(zhǔn)參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病寄生蟲病學(xué)、肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的《病毒性肝炎防治方案(2000年9月·西安)》中肝炎后肝硬化的診斷標(biāo)準(zhǔn)以及2001年10月中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝臟病學(xué)會(huì)制定的《酒精性肝病診斷標(biāo)準(zhǔn)(草案)》中酒精性肝硬化的診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為肝硬化患者。正常對(duì)照組納入健康人,排除急慢性肝膽及其它消化道疾病,常規(guī)檢查未見(jiàn)異常。所以研究對(duì)象在采集糞便標(biāo)本前4周均未應(yīng)用抗生素及微生態(tài)制劑。 2、糞便細(xì)菌培養(yǎng) 天平稱取0.5g糞便,用布氏肉湯進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋(10-2～10-7)。根據(jù)不同的稀釋倍數(shù),取20uL菌液滴種于腸桿菌、腸球菌、葡萄球菌、酵母菌、擬桿菌、雙歧桿菌、消化鏈球菌、乳酸桿菌、真桿菌及梭菌的選擇性培養(yǎng)基上。每個(gè)稀釋度在相應(yīng)培養(yǎng)基中定量接種3個(gè)液滴,以便計(jì)算平均值。以上10種腸道細(xì)菌中,其中前4種為需氧菌,置于37℃普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h,后6種為厭氧菌,置于厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。觀察結(jié)果并計(jì)數(shù),以每克濕糞的菌落形成單位(colony forming unit, CFU)的對(duì)數(shù)值表示。 3、糞便總DNA提取 每例糞便樣本稱取200mg,按TIANamp Stool DNA Kit (TIANGEN)產(chǎn)品說(shuō)明書,提取基因組DNA,并測(cè)定每份DNA樣品的OD260/280值與濃度,于-20℃保存。 4、細(xì)菌引物特異性檢測(cè) 取正常對(duì)照者的糞便DNA進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系25μL:Premix Taq12.5μL,,上下游引物各1μL, DNA模板1μL, ddH2O9.5μL;反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5mmin；94℃變性30s、退火30s(溫度見(jiàn)表2)、72℃延伸1min,共30個(gè)循環(huán)：72℃最后延伸10min。以1000bp DNA Ladder為標(biāo)準(zhǔn),用1.5%瓊脂糖凝膠分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。 5、細(xì)菌實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)10倍稀釋,獲得101-107系列拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板,構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)體系為20uL:SYBR Green Master Mix10uL,上下游引物各1uL,模板DNA5uL, ddH2O3μL;反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；95℃變性l0s、退火溫度(腸桿菌屬58℃,腸球菌屬52℃,乳酸桿菌屬58℃,雙歧桿菌屬58℃,擬桿菌屬60℃,梭菌屬60℃)20s、72℃延伸30s,共45個(gè)循環(huán)；反應(yīng)完畢后進(jìn)行溶解曲線分析,判斷產(chǎn)物特異性。將待測(cè)糞便DNA樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋后,體系與條件同上,進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。 6、宏基因組學(xué)分析 針對(duì)細(xì)菌16S rRNA的V4-V6區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)通用引物進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系25μL:Premix Taq10μL,上下游引物各0.5μL, DNA模板SμL, ddH2O9μL;反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min；94℃變性30s、59℃退火30s、72℃延伸45s,共25個(gè)循環(huán)：72℃最后延伸5min。將PCR產(chǎn)物用illumina HiSeq2000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序,得到數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析。 7、血清內(nèi)毒素含量檢測(cè) 所有研究對(duì)象的外周靜脈血標(biāo)本制得血清標(biāo)本后,按照顯色基質(zhì)鱟試劑盒(廈門鱟試劑廠)說(shuō)明書測(cè)定血清內(nèi)毒素含量。 8、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析。細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果的數(shù)據(jù)用Mean±SD表示,其余計(jì)量資料的數(shù)據(jù)用M(中位數(shù))表示。兩樣本比較采用兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)中的Mann-Whitney U檢驗(yàn),多樣本之間的比較采用多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)中的Kruskal-Wallis H檢驗(yàn),相關(guān)性比較采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn),率的比較采用卡方檢驗(yàn)。雙側(cè)P0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1、傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng) 與對(duì)照組比較,肝硬化患者腸桿菌(Z=-2.030,P=0.042)、葡萄球菌(Z=-1.974,P=0.048)、酵母菌(Z=-2.413,P=0.016)數(shù)量顯著增加；擬桿菌(Z=-2.198,P=0.028)、乳酸桿菌(Z=-2.044,P=0.041)、梭菌(Z=-2.566,P=0.010)數(shù)量顯著降低。 2、細(xì)菌實(shí)時(shí)定量PCR 比較對(duì)照組,肝硬化組腸桿菌(Z=-3.963,P=0.000)、腸球菌(Z=-6.762,P=0.000)數(shù)量顯著增高；乳酸桿菌(Z=-7.093,P=0.000)、雙歧桿菌(Z=-5.186,P=0.000)、擬桿菌(Z=-6.058,P=0.000)及梭菌(Z=-4.268,P=0.000)數(shù)量顯著降低。 3、宏基因組學(xué)分析 肝硬化組與對(duì)照組相比,腸道菌群具有顯著差異,并與肝功分級(jí)相關(guān),且具有特征性的菌屬,其中厚壁菌門的韋榮球菌科數(shù)量顯著增加,疣微菌門、擬桿菌門的擬桿菌科、紫單胞菌科,厚壁菌門的氨基酸球菌屬以及變形菌門的弧菌科數(shù)量顯著減少。 4、定量分析肝硬化患者不同肝功分級(jí)間菌群變化 腸桿菌(x2=13.321,P=0.001)、腸球菌(x2=7.403,P=0.025)、擬桿菌(x2=13.425,P=0.001)、梭菌(x2=12.277,P=0.002)、乳酸菌(x2=9.314,P=0.000)及雙歧菌(x2=6.760,P=0.034)的數(shù)量在肝硬化患者肝功能不同分級(jí)間存在顯著差異。 5、定量分析肝硬化患者菌群紊亂與預(yù)后關(guān)聯(lián) 腸桿菌數(shù)量與肝功Child分級(jí)(R=0.241, P=0.002)、CTP評(píng)分(R=0.235,P=0.003)、MELD預(yù)后評(píng)分(R=0.231,P=0.010)水平均呈正相關(guān)；乳酸桿菌、梭菌數(shù)量分別與肝功Child分級(jí)(前者R=-0.276,P=0.000；后者R=-0.532,P=0.000)、CTP評(píng)分(前者R=-0.280,P=0.000；后者R=-0.420, P=0.000)、MELD預(yù)后評(píng)分(前者R=-0.227,P=0.000；后者R=-0.435,P=0.011)均呈負(fù)相關(guān)。 6、內(nèi)毒素水平與肝硬化不同分級(jí)、預(yù)后關(guān)聯(lián) 與對(duì)照組比較,肝硬化組內(nèi)毒素(Z=-7.593,P=0.000)水平顯著增高。肝硬化組中,內(nèi)毒素(x2=36.168,P=0.000)水平在不同肝功分級(jí)患者中存在顯著差異,其水平隨著肝功能的下降呈顯著升高趨勢(shì)；內(nèi)毒素水平與肝功Child分級(jí)(R=0.44,P=0.000)、CTP評(píng)分(后者R=0.30,P=0.000)、XMELD預(yù)后評(píng)分(R=0.37,P=0.000)呈正相關(guān)。 結(jié)論 1、肝硬化患者普遍存在不同程度的腸道菌群失衡,其中腸桿菌數(shù)量的增加以及擬桿菌、乳酸菌與梭菌數(shù)量的減少在細(xì)菌培養(yǎng)及定量PCR中保持一致。 2、腸桿菌數(shù)量的增加、乳酸桿菌及梭菌數(shù)量的減少,與肝硬化肝功分級(jí)嚴(yán)重程度及不良預(yù)后之間具有顯著的正相關(guān)。 3、梭菌有可能對(duì)肝硬化患者的病情預(yù)后起著一定的積極作用,可能成為一種新生的益生菌制劑,有待進(jìn)一步研究證實(shí)。 4、傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)、實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)于細(xì)菌定量結(jié)果具有良好一致性。宏基因組學(xué)則更加直觀、完整的反映腸道菌群的多樣性,發(fā)現(xiàn)更多細(xì)微的菌群失衡。 5、肝硬化患者普遍存在的內(nèi)毒素血癥可能是加速病情惡化及影響患者預(yù)后的重要因素。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2012
【中圖分類】：R575.2
【部分圖文】：

1.3.5宏基因組學(xué)分析肝硬化組（n=92例）與對(duì)照組（n=31例）相比，腸道細(xì)菌群落各自較集中的分布在不同的區(qū)域內(nèi)，兩者具有顯著差異，詳見(jiàn)圖1-4-1。肝硬化不同肝功分級(jí)下（A級(jí)n=65例，B級(jí)n=21例，C級(jí)n=6例），腸道細(xì)菌與對(duì)照組相比，均具有顯著差異(P均為0.000)。其中，肝功B級(jí)差異最大，詳見(jiàn)圖1-4-2及圖1-4-3。肝硬化腸道菌群亦具有特征性的菌屬，其中厚壁菌門的韋榮球菌科數(shù)量顯著增力口，撫微菌門、擬桿菌門的擬桿菌科、紫單胞菌科，厚壁菌門的氨基酸球菌屬以及變形菌門的弧菌科數(shù)量顯著減少，詳見(jiàn)圖1-4-4。

1.3.7菌群失衡與并發(fā)癥的關(guān)系肝硬化并發(fā)癥與腸道菌群紊亂有一定的關(guān)聯(lián)（見(jiàn)表1-6)。值得注意的是，腸球菌與伴肝癌發(fā)生率呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)R為0.159);腸桿菌與伴自發(fā)性腹膜炎的發(fā)生率呈正相關(guān)（R為0.172);梭菌分別與伴自發(fā)性腹膜炎的發(fā)生率呈負(fù)相關(guān)（R為-0.272);乳酸桿菌分別與伴自發(fā)性腹膜炎、腹水、肝性腦病的發(fā)生率均呈負(fù)相關(guān)（R分別為-0.220，-0.225，-0.194)；擬桿菌與總體并發(fā)癥呈負(fù)相關(guān)（R 為-0.183)。21

肝硬化組中，不同肝功分級(jí)間的患者，其血清內(nèi)毒素水平均顯著不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見(jiàn)表24-1，圖2-1。且內(nèi)毒素水平與肝功Child分級(jí)、CTP評(píng)分、MELD預(yù)后評(píng)分呈正相關(guān)（R分別為0.44、0.30、0.37)，詳見(jiàn)表2-4-2。30
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2858177