慢加急性肝衰竭(Acute on chronic liver failure, ACLF)是指在慢性肝病基礎(chǔ)上,短期內(nèi)發(fā)生急性肝功能失代償?shù)闹饕R床表現(xiàn)。常見的病因包括(1)感染因素：嗜肝或非嗜肝病毒、乙型肝炎(顯性或隱性)或丙型肝炎再活動；(2)非感染因素：有飲酒史、肝毒性藥物(中草藥)、手術(shù)以及自身免疫性肝病等。在我國,慢加急性肝衰竭主要發(fā)生于慢性乙型病毒性肝炎(Chronic hepatitis B, CHB)基礎(chǔ)上。同時,乙肝病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染又是原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)最主要的致病因素,HCC的發(fā)生發(fā)展的分子機制涉及癌基因、抑癌基因、生長因子、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因及其受體等多個環(huán)節(jié),抑癌基因的表達降低參與了HCC的發(fā)生。 谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶PI (Glutathione S-transferase PI, GSTP1)是人體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化最重要的Ⅱ相代謝酶之一,是細胞抗氧化損傷、抗癌變的主要解毒酶。GSTP1屬于谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(Glutathione Stransferase, GST)家族,該家族是還原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)發(fā)揮對抗脂質(zhì)過氧化、保護肝細胞膜、清除氧自由基和促進肝臟合成功能等作用時必需的一組催化酶。GSTP1基因啟動子區(qū)發(fā)生甲基化時,會使GSTP1的表達降低,對肝臟的保護作用降低,可能會加重氧化損傷對肝功能的損害。 本論文通過檢測ACLF患者外周血中的GSTP1啟動子區(qū)甲基化情況和氧化損傷狀態(tài)以及肝癌患者的GSTP1蛋白和mRNA表達情況.來研究GSTP1在ACLF和HCC發(fā)生中所發(fā)揮的作用。 中文摘要第一部分 谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶P1啟動子區(qū)甲基化與慢加急性肝衰竭患者氧化損傷的相關(guān)性研究 肝衰竭是多種因素引起的嚴重肝臟損害,導(dǎo)致其合成、解毒、排泄和生物轉(zhuǎn)化等功能發(fā)生嚴重障礙或失代償,出現(xiàn)以凝血機制障礙和黃疸、肝性腦病、腹水等為主要表現(xiàn)的一組臨床癥候群。根據(jù)病理組織學(xué)特征和病情發(fā)展速度,肝衰竭可被分為四類：急性肝衰竭(acute liver failure, ALF)、亞急性肝衰竭(subacute liver failure, SA)、慢加急性肝衰竭Acute on chronic liver failure, ACLF)和慢性肝衰竭(chronic liver failure, CLF)。慢加急性肝衰竭是指在慢性肝病基礎(chǔ)上,短期內(nèi)發(fā)生急性肝功能失代償?shù)闹饕R床表現(xiàn)。常見的病因包括感染因素：嗜肝或非嗜肝病毒、乙型肝炎(顯性或隱性)或丙型肝炎再活動；非感染因素：有飲酒史、肝毒性藥物(中草藥)、手術(shù)以及自身免疫性肝病等。在我國,慢加急性肝衰竭主要發(fā)生于慢性乙型病毒性肝炎(Chronic hepatitis B, CHB)患者。除病毒性肝炎外,常見的肝衰竭病因還有妊娠急性脂肪肝、藥物性肝病和酒精性肝病。 谷胱甘肽毓基轉(zhuǎn)移酶P1(Glutathione S-transferase P1，GSTP1)是人體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化最重要的Ⅱ相代謝酶之一,是細胞抗氧化損傷、抗癌變的主要解毒酶。GSTP1屬于谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)家族,該家族是還原型谷胱甘肽(GSH)發(fā)揮對抗脂質(zhì)過氧化、保護肝細胞膜、清除氧自由基和促進肝臟合成功能等作用時必需的一組催化酶。GSTP1基因啟動子區(qū)發(fā)生甲基化時,會使GSTP1的表達降低,對肝臟的保護作用降低,可能會加重氧化損傷對肝功能的損害。GSTP1基因啟動子甲基化在各種腫瘤中研究較多,如肝癌,前列腺癌等。但慢加急性肝衰竭患者中是否存在GSTP1啟動子區(qū)甲基化的情況及其與氧化損傷的相關(guān)性尚未有研究。 目的 在本研究中,我們致力于分析乙肝病毒感染相關(guān)的ACLF患者的GSTP1基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)和氧化損傷水平,并與慢性乙型病毒性肝炎患者進行比較,觀察GSTP1甲基化是否ACLF的發(fā)生及氧化損傷水平具有相關(guān)性以及評價它們的相關(guān)性。 方法 1.收集10例正常人、48例ACLF患者和48例CHB患者外周血5ml,密度梯度離心法分離外周血單個核細胞和血清,用試劑盒提取單個核細胞中的基因組DNA。 2.DNA甲基化修飾試劑盒處理DNA將DNA分子中的未甲基化的胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?U)。甲基化特異性PCR(MSP-PCR)法檢測外周血中GSTP1基因啟動子區(qū)的甲基化情況。采用文獻的引物并采用其PCR條件,凝膠電泳檢測所得產(chǎn)物。 3.采用逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR, QRT-PCR)的方法來檢測ACLF患者和CHB患者外周血中的GSTP1的mRNA表達水平。采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)來測定HCC患者和CHB患者血清中的丙二醛(MDA)和還原型谷胱甘肽(GSH)含量,其中,MDA的血清水平含量代表氧化損傷的水平,GSH的水平代表患者血清的抗氧化損傷水平。 結(jié)果 48例ACLF患者中有13例,48例CHB患者中有4例(8.57%),檢測至GSTP1甲基化,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.79,P=0.03),提示GSTP1甲基化可能參與CHB患者進展為ACLF。 ACLF患者外周血單個核細胞中的GSTP1mRNA表達水平較CHB患者的表達水平明顯降低(P0.01)。ACLF患者中GSTP1甲基化組的GSTP1mRNA表達水平較非甲基化組明顯降低(P=0.01)。ACLF患者中GSTP1甲基化組和非甲基化組之間的臨床指標如ALT、AST、PTA之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),但甲基化組的TBIL水平明顯高于非甲基化組(P=0.04)。ACLF患者血清中的MDA水平較CHB患者的水平明顯升高(0.68±0.3ng/ml vs0.42±0.18ng/ml, P=0.02), ACLF患者血清中的GSH的水平較CHB患者的水平明顯降低(0.68±0.3ng/ml vs0.42±0.18ng/ml, P=0.02)。 ACLF患者中GSTP1甲基化組的MDA水平也明顯高于非甲基化組(14.45±6.23pmol/mg vs11.76±3.94pmol/mg, P=0.04),兩組患者的GSH水平?jīng)]有統(tǒng)計學(xué)上的差異。ACLF患者中GSTP1甲基化組和非甲基化組之間的病情程度(MELD積分)沒有顯著差別(20.32±4.72vs18.57±5.19, P=0.35)。 MDA水平與MELD積分之間存在正相關(guān)(r=0.579,P0.01),即氧化損傷程度與ACLF患者的病情嚴重程度成正相關(guān)。 結(jié)論 GSTP1基因啟動子區(qū)的異常甲基化參與了氧化損傷對ACLF患者的肝功能損害,并且氧化損傷程度與患者的病情嚴重程度成正相關(guān)。 中文摘要第二部分 肝癌患者與慢性乙型病毒性肝炎患者外周血中的GSTP1表達水平和氧化損傷狀態(tài)的比較 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染與急慢性肝炎、肝硬化和原發(fā)性肝細胞癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。我國的原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)主要發(fā)生于慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B, CHB)的基礎(chǔ)上。肝癌的發(fā)生發(fā)展的分子機制涉及癌基因、抑癌基因、生長因子、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因及其受體等多個環(huán)節(jié)。既往多項研究顯示肝癌的發(fā)生與某些抑癌基因的啟動子區(qū)甲基化相關(guān),如凋亡相關(guān)基因、p16基因、肝細胞生長因子激活劑抑制因子等,這些基因啟動子區(qū)的甲基化會導(dǎo)致抑癌基因的表達減少,從而促進肝癌的發(fā)生和進展。 谷胱甘肽筑基轉(zhuǎn)移酶P1(GSTP1)是人體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化最重要的Ⅱ相代謝酶之一,是細胞抗損傷、抗癌變的主要解毒系統(tǒng)。以往的研究表明多種腫瘤患者體內(nèi)GSTP1的表達水平存在明顯異常。例如,在前列腺癌、胃癌以及肝細胞肝癌中研究者發(fā)現(xiàn)存在GSTP1的啟動子區(qū)甲基化,由基因啟動子區(qū)甲基化導(dǎo)致的表達量減少可能參與了上述腫瘤的發(fā)生,但GSTP1蛋白表達水平的改變以及肝癌患者的氧化損傷狀態(tài)研究較少。 目的 在本研究中,我們致力于分析乙肝病毒相關(guān)的肝癌患者的GSTP1蛋白表達水平、mRNA表達水平以及氧化損傷狀態(tài),并與慢性乙型病毒性肝炎患者進行比較,觀察GSTP1的表達水平以及氧化損傷狀態(tài)是否與肝癌的發(fā)生具有相關(guān)性。 方法 我們首次采用流式細胞儀檢測的方法來測定38例乙肝病毒相關(guān)肝癌(HCC)患者和38例CHB患者以及10名健康對照者外周血中的GSTP1的表達水平。采用逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR, QRT-PCR)的方法來檢測HCC患者和CHB患者外周血中的GSTP1的nRNA表達水平。采用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)來測定HCC患者和CHB患者血清中的丙二醛(MDA)和黃嘌呤氧化酶(XOD),還原型谷胱甘肽(GSH)以及谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)含量,其中,MDA和XOD的血清水平含量代表氧化損傷的水平,GSH和GST的水平代表患者血清的抗氧化損傷水平。 結(jié)果 乙肝病毒相關(guān)的HCC患者外周血中的GSTP1蛋白表達水平較CHB患者水平明顯降低(陽性百分率1.13士0.55%vs2.72±1.06%,P=0.005；平均熒光強度2.63±1.02vs5.63±2.33, P=0.002)。與GSTP1蛋白表達水平的變化相似,HCC患者外周血單個核細胞中的GSTP1的mRNA表達水平較CHB患者的表達水平明顯降低(中位數(shù)：0.04；范圍：0.005-0.33vs.中位數(shù)：0.06；范圍：0.02-1.05；P=0.01)。HCC患者血清中的MDA和XOD水平較CHB患者的水平明顯升高(19.13±2.01pmol/mg vs12.99±3.55pmol/mg, P=0.006;183.23±78.09mIU/ml vs53.96±29.28mIU/ml, P0.01), HCC患者血清中的GSH和GST的水平較CHB患者的水平明顯降低(2.81±1.40ng/ml vs5.79±3.03ng/ml, P0.01;0.26±0.12μg/ml vs1.10±0.56μg/ml, P0.01)。 結(jié)論 HCC患者的GSTP1的蛋白和mRNA表達水平較CHB患者明顯降低,GSTP1表達水平的變化可能參與了患者從CHB到HCC的進展,HCC患者的氧化損傷水平較CHB明顯升高,GSTP1的表達水平降低可能與肝癌的氧化損傷水平較高相關(guān)。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R575.5
【文章目錄】：
中文摘要
    第一部分
    第二部分
英文摘要
    第一部分
    第二部分
符號說明
第一部分 AGLF患者的GSTP1甲基化與氧化損傷狀態(tài)的研究
    前言
    材料和方法
    結(jié)果
    討論
    結(jié)論
    附圖表
    參考文獻
第二部分 肝癌患者與慢乙肝患者外周血中的GSTP1表達水平的比較
    前言
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    結(jié)論
    附圖表
    參考文獻
附件英文 第一部分
附件英文 第二部分
致謝
發(fā)表論文及主要成績
學(xué)位論文評閱及答辯情況表

【參考文獻】

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本文編號：2857763