【研究背景】膿毒癥(sepsis)是指由嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、燒傷、術(shù)后感染及急危重病引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),并伴有危及生命的器官功能障礙,進(jìn)一步可發(fā)展成為嚴(yán)重膿毒癥、膿毒性休克及多器官功能障礙綜合征(multiple organs dysfunction syndrome,MODS),甚至死亡。當(dāng)下,由膿毒癥引起的膿毒癥休克和多器官功能障礙已成為重癥監(jiān)護(hù)病房(intensive care unit,ICU)的最常見死因之一。由于膿毒癥的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜,即便在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)高度發(fā)展的今天,臨床治療依然收效甚微,死亡率高居不下。因此,進(jìn)一步探討膿毒癥的發(fā)生機(jī)制、尋找到新的預(yù)防、治療手段已成為亟需解決的重要科學(xué)問題。急性胰腺炎(Acute Pancreatitis,AP)是一種由多種病因?qū)е乱让冈谝认賰?nèi)被激活后引起胰腺組織自身消化、水腫、出血甚至壞死的炎癥反應(yīng),臨床表現(xiàn)多樣,變化范圍可從經(jīng)支持治療后輕癥自限性的疾病到高并發(fā)癥和死亡率的威脅生命的疾病。膿毒癥是繼發(fā)重癥胰腺損傷的重要原因,胰腺急性損傷后可引起炎癥介質(zhì)大量釋放,加劇機(jī)體炎癥反應(yīng)及應(yīng)激狀態(tài),使病情進(jìn)一步惡化。盡管經(jīng)大量臨床及試驗(yàn)潛在治療藥物或手術(shù)處理,其中約10~20%病人死于多器官衰竭,這在一定程度上由于治療AP可供選擇的藥理學(xué)選擇缺乏。研究顯示胰酶的活化、炎癥、氧化應(yīng)激及核因子NF-κB是AP的重要病理生理組成。一氧化碳(Carbonmonoxide,CO)作為繼一氧化氮以后發(fā)現(xiàn)的第二種重要的氣體第二信使分子,其具有舒張血管和支氣管平滑肌、抑制血小板聚集、抑制炎癥反應(yīng)、抗凋亡、抗增殖等多種生理學(xué)作用,在神經(jīng)、呼吸、循環(huán)等生理過程和抑制急性炎性反應(yīng)、臟器缺血再灌注損傷、器官移植排斥反應(yīng)等病理過程中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。一氧化碳釋放分子(CO-releasing molecules,CORM-2)是一類新合成的可以釋放一氧化碳?xì)怏w的過渡金屬化合物,其可釋放一氧化碳所以受到越來越多的關(guān)注并可能發(fā)展其藥用。已有研究結(jié)果顯示CORM-2釋放的CO可以顯著的改善盲腸結(jié)扎并穿孔(CLP)小鼠以及LPS刺激小鼠的炎癥反應(yīng),有效保護(hù)小鼠重要臟器減少損傷,改善機(jī)體缺血再灌注,提高實(shí)驗(yàn)小鼠的生存率。然而,關(guān)于一氧化碳釋放分子在改善炎性反應(yīng),減少胰腺損傷的保護(hù)機(jī)制方面,即細(xì)胞信號通路問題上的研究,目前尚未有報(bào)道。基于此,本研究主要是分析了一氧化碳在膿毒癥小鼠模型和重癥胰腺炎小鼠模型所致胰腺損傷的保護(hù)作用,并探討了NF-κB細(xì)胞通路在這種保護(hù)作用中所起到的分子機(jī)制�！狙芯糠椒ā垦芯緾ORM-2對CLP模型小鼠胰腺的保護(hù)作用。清潔級健康雄性C57BL/6小鼠68只(其中48只用于生存率分析,20只其他實(shí)驗(yàn))隨機(jī)分成4組:假手術(shù)組(Sham)組,CLP組,CLP+CORM-2組及CLP+iCORM-2組,假手術(shù)組或CLP后即開始計(jì),分別記錄各組72h生存率,于1、2、4、6、8、10、12、16、20、24、36h測定各組小鼠血糖水平,并且在第6小時(shí)、12小時(shí)及24小時(shí)對小鼠進(jìn)行異氟烷麻醉下心臟穿刺采血,最后取胰腺組織于液氮中凍存或用10%福爾馬林固定,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。利用全自動生化分析儀檢測檢測血清淀粉酶、脂肪酶的水平,取胰腺組織HE染色并進(jìn)行病理學(xué)評分,檢測過氧化物酶(MPO)活力。C57BL/6小鼠腹腔注射雨蛙素(50μg/kg)每小時(shí)一次,共10次,建立ANP小鼠模型;將模型小鼠分組為對照組(Control組),急性出血壞死性胰腺炎(ANP組),CORM-2干預(yù)組(AP+CORM-2組),iCORM-2干預(yù)組(AP+iCORM-2組)。CORM-2或iCORM-2于第一次注射雨蛙素30min后,各組均于第一次雨蛙素注射12小時(shí)后收集小鼠血液及胰腺組織。運(yùn)用全自動生化儀檢測血清中淀粉酶、脂肪酶、AST、ALT的水平,對胰腺組織進(jìn)行HE染色,TUNEL法檢測胰腺組織凋亡,稱重法檢測胰腺組織濕干比,分光光度計(jì)檢測胰腺組織中MPO(髓過氧化物酶)的活性,使用酶標(biāo)儀對胰腺組織中MDA(丙二醛)進(jìn)行檢測。采用ELISA法檢測重癥胰腺炎模型小鼠血漿及胰腺組織中細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)水平,免疫組化的方法檢測胰腺組織中ICAM-1及VCAM-1的表達(dá)情況,運(yùn)用Western blot方法對NF-κB、P-IκBα的水平進(jìn)行檢測�！狙芯拷Y(jié)果】(1)CORM-2的干預(yù)對可改善CLP模型的生存率,對于血糖影響不明顯。與Sham小鼠相比,CLP術(shù)后血清淀粉酶水平在6 h即開始升高,在CLP術(shù)后24 h后增加更為明顯。在CLP術(shù)后6 h、12h和24 h,CORM-2的干預(yù)均能顯著降低了血清淀粉酶的水平。與CLP組相比,使用iCORM-2治療的膿毒癥小鼠的血清淀粉酶活性沒有改變。在血清脂肪酶水平上也有類似的結(jié)果;通過對各組小鼠胰腺組織HE染色結(jié)果顯示:Sham組小鼠的胰腺顯示正常的結(jié)構(gòu),而膿毒癥小鼠的胰腺組織在CLP術(shù)24h表現(xiàn)出嚴(yán)重的病理損傷。膿毒癥小鼠的胰腺組織具有典型的水腫、炎性細(xì)胞浸潤和腺泡細(xì)胞壞死。在CORM-2干預(yù)后,顯著降低了胰腺損傷的組織學(xué)損傷的程度,而在iCORM-2治療組中沒有發(fā)現(xiàn)胰腺損傷的減輕。MPO活性檢測的結(jié)果顯示:與假手術(shù)組相比,CLP術(shù)后6 h、12 h和24h,小鼠胰腺組織MPO活性明顯增加,并在24 h時(shí)更加明顯。CORM-2的治療可明顯減弱MPO活性,CORM-2的治療降低了胰腺組織中性粒細(xì)胞的浸潤。CLP組與CLP+iCORM-2組之間無顯著性差異。上述結(jié)果提示在膿毒癥時(shí),胰腺組織亦是易受損害的器官之一,CORM-2干預(yù)對這一損害有一定的保護(hù)作用,而胰腺組織病理學(xué)評分的定量分析說明與CLP組相比,CORM-2治療在CLP誘導(dǎo)的胰腺損傷中發(fā)揮了保護(hù)作用。(2)通過雨蛙素連續(xù)腹腔注射成功建立急性出血壞死性胰腺炎小鼠模型。CORM-2能夠明顯降低雨蛙素誘導(dǎo)的ANP小鼠血清淀粉酶、脂肪酶水平,減輕腺泡細(xì)胞的凋亡(TUNEL),減輕胰腺組織損傷;CORM-2能夠明顯的提高雨蛙素誘導(dǎo)的ANP小鼠生存率。以上結(jié)果提示,CORM-2可明顯的保護(hù)急性出血性壞死性胰腺炎小鼠的臟器功能,提高小鼠生存率。(3)與假手術(shù)組相比,膿毒癥小鼠胰腺組織促炎細(xì)胞因子IL-6,IL-1β及TNF-α顯著增加,CORM-2干預(yù),胰腺組織IL-6、IL-1β和TNF-α的表達(dá)減少,然而,iCORM-2治療不施加任何影響這些細(xì)胞因子的表達(dá)。膿毒癥小鼠NF-κB p65及磷酸化的-IκB-α(p-IκB-α)表達(dá)水平明顯升高,而CORM-2干預(yù)則抑制了其表達(dá),而iCORM-2干預(yù)對此無改變。CORM-2能夠明顯降低雨蛙素誘導(dǎo)的ANP小鼠減輕血清及胰腺組織細(xì)胞因子水平(TNF-α、IL-1β、IL-6)的表達(dá),CORM-2能夠明顯的抑制雨蛙素誘導(dǎo)的ANP小鼠胰腺組織NF-κB p65及磷酸化的-IκB-α(p-IκB-α)表達(dá)水平,抑制因NF-κB活化、表達(dá)所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激產(chǎn)物增多。綜上,本研究采用小鼠膿毒癥模型和急性胰腺炎的胰腺損傷模型,對胰腺炎癥反應(yīng)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,并使用CORM-2進(jìn)行干預(yù),提示了CORM-2通過抑制NF-κB信號通路的活化來抑制機(jī)體的炎癥反應(yīng),從而對膿毒癥和胰腺炎時(shí)胰腺組織的損傷起保護(hù)作用�！狙芯拷Y(jié)論】本研究發(fā)現(xiàn),膿毒癥時(shí),小鼠胰腺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞表面附著的ICAM-1、VCAM-1明顯增多,蛋白NF-κB的表達(dá)量也明顯增多,CORM-2干預(yù)可以明顯的抑制上述炎癥指標(biāo),這種保護(hù)作用是通過NF-κB細(xì)胞信號通路而發(fā)生作用的。
【學(xué)位單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R576
【部分圖文】：

圖 1.1.2 膿毒癥時(shí)微循環(huán)障礙的機(jī)制15Figure 1.1.2 Microcirculatory dysfunction in sepsis1.1.3 膿毒癥的免疫失衡在過去的幾十年中，當(dāng)入侵的微生物克服了宿主的物理屏障所代表的第一道

圖 1.1.3 膿毒癥時(shí)免疫失衡32Figure 1.1.3 Imbalance of the immunity in sepsis如果患者在最初的幾天內(nèi)死于膿毒癥，這很可能是由于大量的促炎細(xì)胞因子所致。例如，在某些形式的膿毒癥中，如腦膜炎球菌血癥(圖 1.1.3A)，循環(huán)

圖 1.1.3-1 膿毒癥患者的免疫應(yīng)答可能的全身表現(xiàn)32l representation of possible immunological responses in pati素，包括細(xì)菌負(fù)荷、病原體毒力、宿主共存性和宿可能有所不同。(A)抗炎反應(yīng)(橙色線)與壓倒性致炎
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本文編號：2848879