第一部分NRF2在NAFLD病人及NAFLD、胰島素抵抗動物及細胞模型中的表達目的:探索NRF2在NAFLD病人和NAFLD、胰島素抵抗動物細胞模型中的表達,了解NRF2與NAFLD和胰島素抵抗的關系。方法:分別采用實時定量PCR技術(qPCR)和蛋白免疫印跡法檢測普食組C57雄性小鼠(ND-WT,20周齡)、高脂組C57雄性小鼠(HFD-WT,8周齡開始高脂飲食喂養(yǎng),共喂養(yǎng)12周)、db/m普食組(20周齡)、db/db普食組(20周齡)、NAFLD病人肝臟及HepG2細胞(牛血清白蛋白和棕櫚酸處理24h)中NRF2 mRNA和蛋白的表達情況。結果:在NAFLD病人和NAFLD、胰島素抵抗動物細胞模型中,NRF2 mRNA和蛋白含量均顯著升高。結論:在NAFLD病人及NAFLD、胰島素抵抗動物及細胞模型中的表達均發(fā)現(xiàn)NRF2表達顯著升高,而目前尚不清楚這種升高是由于體內糖脂代謝異常所導致的代償性反應還是因為NRF2的升高導致體內糖脂代謝異常,因此需要進一步的深入研究。第二部分NRF2對肝臟糖脂代謝影響的體內研究目的:探討飲食誘導下Nrf2基因敲除對小鼠糖脂代謝的影響。方法:選取8周齡雄性野生型(WT)小鼠和Nrf2全身敲除型(Nrf2-/-)小鼠各60只,根據(jù)不同飲食喂養(yǎng)類型隨機分為4組:WT小鼠普食喂養(yǎng)組(ND-WT組)、WT小鼠高脂飲食喂養(yǎng)組(HFD-WT組)、Nrf2-/-小鼠普食喂養(yǎng)組(ND-Nrf2-/-組)、Nrf2-/-小鼠高脂飲食喂養(yǎng)組(HFD-Nrf2-/-組),分別對各組小鼠進行飲食干預12周和24周,喂養(yǎng)期間每周定時檢測體重。于基線、12周末和24周末行IPGTT、IPITT、IPPTT及鼠尾血壓監(jiān)測試驗;于造模12周末進行高胰島素正葡萄糖鉗夾試驗并取血檢測血脂、空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)等指標,從而評價Nrf2基因敲除對機體葡萄糖、血脂代謝及血壓的影響。結果:基線時,WT組小鼠和Nrf2-/-組小鼠體重沒有差異,IPGTT、IPITT、IPPTT顯示在各負荷狀態(tài)下兩組小鼠血糖變化沒有顯著差異。飲食誘導造模12周時,與HFD-WT組小鼠比較,HFD-Nrf2-/-組小鼠體重、GTT曲線下面積、ITT曲線下面積、PTT曲線下面積、鉗夾時肝糖生成率(HGP)、TG、TC、FBG、FINS均顯著增加,鉗夾時葡萄糖輸注率(GIR)、葡萄糖消失率(GRd)、肝糖抑制率等明顯降低,而普食喂養(yǎng)組未出現(xiàn)上述變化。飲食誘導造模24周時,高脂組和普食組出現(xiàn)與上述變化趨勢相似的結果。造模12周和24周時,分別與ND-WT和HFD-WT組小鼠比較,ND-Nrf2-/-和HFD-Nrf2-/-組小鼠鼠尾血壓沒有顯著差異。結論:高脂飲食誘導下Nrf2基因敲除可導致小鼠胰島素抵抗、葡萄糖、血脂代謝紊亂,而對血壓沒有顯著影響。第三部分NRF2調控肝臟糖脂代謝的分子機制目的:觀察Nrf2基因敲除對糖脂代謝及胰島素信號通路的影響,探討NRF2參與肝臟糖異生的分子機制。方法:采用qPCR法檢測各組小鼠肝臟組織、小鼠原代肝細胞(MPHs)、Nrf2質粒過表達HepG2模型細胞中糖脂代謝相關基因mR NA相對表達水平。Western blot檢測各組小鼠肝臟組織中胰島素受體(IR)、蛋白激酶B(AKT)、糖原合成酶激酶3β(GSK3β)、葡萄糖轉運體2、4(GLUT2、GLUT4)磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)、葡萄糖6磷酸酶(G6Pase)、AMP依賴的蛋白激酶α(AMPKα)、過氧化物酶增殖物激活受體γ協(xié)同激活因子1-α(PGC1α)、腺苷反應元件結合蛋白(CREB)及其對應的磷酸化蛋白表達水平。Nrf2過表達質粒轉染AMPKα-/-小鼠原代肝細胞,并在棕櫚酸干預后檢測CREB、CRTC2、PEPCK、G6Pase表達水平。采用AMPKα激動劑AICAR預處理WT和Nrf2-/-小鼠原代肝細胞,并在棕櫚酸干預后檢測CREB、CRTC2、PEPCK、G6Pase表達水平。結果:高脂飲食或棕櫚酸干預時Nrf2基因缺失促進肝臟糖異生基因PEPCK、G6Pase mRNA表達,對肝臟糖原代謝及糖酵解相關基因表達沒有顯著影響;使調節(jié)糖異生關鍵基因轉錄的輔激活因子CRTC2表達增加,對PGC1α沒有影響。Nrf2過表達可抑制糖異生基因PEPCK和G6Pase mR NA的表達。高脂飲食誘導和棕櫚酸干預情況下Nrf2缺失能使脂代謝主要相關基因mR NA表達水平升高,而Nrf2過表達抑制脂代謝相關基因mR NA表達。普通飲食喂養(yǎng)下,胰島素信號通路主要成員及AMPKα、CREB、CRTC2、PGC1α等表達均無差異。與HFD-WT組比較,HFD-Nrf2-/-組小鼠肝臟組織p-IR、p-AKT蛋白表達水平顯著降低,p-GSK3β、GLUT2、GLUT4、PGC1α蛋白表達水平無差異,PEPCK、G6Pase和CRTC2表達水平顯著增加,p-AMPKα蛋白表達水平顯著降低,p-CREB蛋白表達水平顯著增加。AMPKα激活后可抵抗棕櫚酸干預時NRF2缺失導致的糖異生基因表達增加,AMPKα敲除小鼠原代肝細胞中NRF2過表達不能降低糖異生相關基因的表達。結論:高脂飲食誘導時Nrf2基因敲除能降低肝臟的胰島素敏感性,促進肝臟糖異生關鍵基因表達,而Nrf2對肝糖異生的調控作用依賴于AMPKα。高脂飲食誘導時Nrf2基因敲除能升高肝臟膽固醇合成和外排、脂肪酸合成、脂肪酸攝取和脂肪酸β-氧化相關關鍵基因表達。
【學位單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R575
【部分圖文】：

圖 1.1 高脂飲食喂養(yǎng) C57 小鼠肝臟 中 Nrf2 的表達Fig 1.1 Expression of Nrf2 in liver of C57 mice fed with high fat diet (A: Nrf2 mRNAexpression; B: NRF2 protein expression). ** P＜0.01 vs ND-WT.圖 1.2 db/db 小鼠肝臟 中 Nrf2 的表達

32圖 1.2 db/db 小鼠肝臟 中 Nrf2 的表達Fig 1.2 Expression of Nrf2 in liver of db/db mice (A: Nrf2 mRNA expression; B: NRF2protein expression). ** P＜0.01 vs db/m.2.2 NRF2 在 NAFLD 病人中表達升高我們獲取 NAFLD 病人肝臟組織后進行 Nrf2 mRNA 和蛋白質的檢測，發(fā)現(xiàn)在 NAFLD 病人肝臟組織中 Nrf2 的表達較正常對照組明顯增加（圖 1.3）

圖 1.3 NAFLD 病人肝臟 中 Nrf2 的表達Fig 1.3 Expression of Nrf2 in liver of NAFLD patients (A. Nrf2 mRNA expression B.NRF2 protein expression). ** P＜0.01 vs normal individuals.2.3 NRF2 在 NAFLD、胰島素抵抗細胞模型中表達升高棕櫚酸造 NAFLD、胰島素抵抗細胞模型是很常用的方法，參考文獻發(fā)現(xiàn)不同研究使用棕櫚酸濃度不同，而干預時間基本為 24h，因此我們應用不同濃度的棕櫚酸處理 HepG2 細胞，根據(jù)文獻檢測糖異生基因 PEPCK 和 G6Pase 確定造 NAFLD、胰島素抵抗模型的濃度。結果顯示使用棕櫚酸終濃度 0.75mM時 PEPCK 和 G6Pase 的 mRNA 表達顯著升高（圖 1.4），并且在實驗過程中觀察到細胞狀態(tài)較低濃度時沒有明顯改變，因此后續(xù)細胞實驗采用棕櫚酸0.75mM 終濃度造 NAFLD、胰島素抵抗細胞模型。如圖 1.5，NRF2 的 mRNA
【參考文獻】

相關碩士學位論文 前1條

1 張亞麗;新基因KLF14過表達影響肝糖代謝及胰島素抵抗的機制研究[D];重慶醫(yī)科大學;2013年

本文編號：2842621