第一部分NRF2在NAFLD病人及NAFLD、胰島素抵抗動物及細(xì)胞模型中的表達(dá)目的:探索NRF2在NAFLD病人和NAFLD、胰島素抵抗動物細(xì)胞模型中的表達(dá),了解NRF2與NAFLD和胰島素抵抗的關(guān)系。方法:分別采用實(shí)時定量PCR技術(shù)(qPCR)和蛋白免疫印跡法檢測普食組C57雄性小鼠(ND-WT,20周齡)、高脂組C57雄性小鼠(HFD-WT,8周齡開始高脂飲食喂養(yǎng),共喂養(yǎng)12周)、db/m普食組(20周齡)、db/db普食組(20周齡)、NAFLD病人肝臟及HepG2細(xì)胞(牛血清白蛋白和棕櫚酸處理24h)中NRF2 mRNA和蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:在NAFLD病人和NAFLD、胰島素抵抗動物細(xì)胞模型中,NRF2 mRNA和蛋白含量均顯著升高。結(jié)論:在NAFLD病人及NAFLD、胰島素抵抗動物及細(xì)胞模型中的表達(dá)均發(fā)現(xiàn)NRF2表達(dá)顯著升高,而目前尚不清楚這種升高是由于體內(nèi)糖脂代謝異常所導(dǎo)致的代償性反應(yīng)還是因?yàn)镹RF2的升高導(dǎo)致體內(nèi)糖脂代謝異常,因此需要進(jìn)一步的深入研究。第二部分NRF2對肝臟糖脂代謝影響的體內(nèi)研究目的:探討飲食誘導(dǎo)下Nrf2基因敲除對小鼠糖脂代謝的影響。方法:選取8周齡雄性野生型(WT)小鼠和Nrf2全身敲除型(Nrf2-/-)小鼠各60只,根據(jù)不同飲食喂養(yǎng)類型隨機(jī)分為4組:WT小鼠普食喂養(yǎng)組(ND-WT組)、WT小鼠高脂飲食喂養(yǎng)組(HFD-WT組)、Nrf2-/-小鼠普食喂養(yǎng)組(ND-Nrf2-/-組)、Nrf2-/-小鼠高脂飲食喂養(yǎng)組(HFD-Nrf2-/-組),分別對各組小鼠進(jìn)行飲食干預(yù)12周和24周,喂養(yǎng)期間每周定時檢測體重。于基線、12周末和24周末行IPGTT、IPITT、IPPTT及鼠尾血壓監(jiān)測試驗(yàn);于造模12周末進(jìn)行高胰島素正葡萄糖鉗夾試驗(yàn)并取血檢測血脂、空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)等指標(biāo),從而評價Nrf2基因敲除對機(jī)體葡萄糖、血脂代謝及血壓的影響。結(jié)果:基線時,WT組小鼠和Nrf2-/-組小鼠體重沒有差異,IPGTT、IPITT、IPPTT顯示在各負(fù)荷狀態(tài)下兩組小鼠血糖變化沒有顯著差異。飲食誘導(dǎo)造模12周時,與HFD-WT組小鼠比較,HFD-Nrf2-/-組小鼠體重、GTT曲線下面積、ITT曲線下面積、PTT曲線下面積、鉗夾時肝糖生成率(HGP)、TG、TC、FBG、FINS均顯著增加,鉗夾時葡萄糖輸注率(GIR)、葡萄糖消失率(GRd)、肝糖抑制率等明顯降低,而普食喂養(yǎng)組未出現(xiàn)上述變化。飲食誘導(dǎo)造模24周時,高脂組和普食組出現(xiàn)與上述變化趨勢相似的結(jié)果。造模12周和24周時,分別與ND-WT和HFD-WT組小鼠比較,ND-Nrf2-/-和HFD-Nrf2-/-組小鼠鼠尾血壓沒有顯著差異。結(jié)論:高脂飲食誘導(dǎo)下Nrf2基因敲除可導(dǎo)致小鼠胰島素抵抗、葡萄糖、血脂代謝紊亂,而對血壓沒有顯著影響。第三部分NRF2調(diào)控肝臟糖脂代謝的分子機(jī)制目的:觀察Nrf2基因敲除對糖脂代謝及胰島素信號通路的影響,探討NRF2參與肝臟糖異生的分子機(jī)制。方法:采用qPCR法檢測各組小鼠肝臟組織、小鼠原代肝細(xì)胞(MPHs)、Nrf2質(zhì)粒過表達(dá)HepG2模型細(xì)胞中糖脂代謝相關(guān)基因mR NA相對表達(dá)水平。Western blot檢測各組小鼠肝臟組織中胰島素受體(IR)、蛋白激酶B(AKT)、糖原合成酶激酶3β(GSK3β)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體2、4(GLUT2、GLUT4)磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)、葡萄糖6磷酸酶(G6Pase)、AMP依賴的蛋白激酶α(AMPKα)、過氧化物酶增殖物激活受體γ協(xié)同激活因子1-α(PGC1α)、腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)及其對應(yīng)的磷酸化蛋白表達(dá)水平。Nrf2過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染AMPKα-/-小鼠原代肝細(xì)胞,并在棕櫚酸干預(yù)后檢測CREB、CRTC2、PEPCK、G6Pase表達(dá)水平。采用AMPKα激動劑AICAR預(yù)處理WT和Nrf2-/-小鼠原代肝細(xì)胞,并在棕櫚酸干預(yù)后檢測CREB、CRTC2、PEPCK、G6Pase表達(dá)水平。結(jié)果:高脂飲食或棕櫚酸干預(yù)時Nrf2基因缺失促進(jìn)肝臟糖異生基因PEPCK、G6Pase mRNA表達(dá),對肝臟糖原代謝及糖酵解相關(guān)基因表達(dá)沒有顯著影響;使調(diào)節(jié)糖異生關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄的輔激活因子CRTC2表達(dá)增加,對PGC1α沒有影響。Nrf2過表達(dá)可抑制糖異生基因PEPCK和G6Pase mR NA的表達(dá)。高脂飲食誘導(dǎo)和棕櫚酸干預(yù)情況下Nrf2缺失能使脂代謝主要相關(guān)基因mR NA表達(dá)水平升高,而Nrf2過表達(dá)抑制脂代謝相關(guān)基因mR NA表達(dá)。普通飲食喂養(yǎng)下,胰島素信號通路主要成員及AMPKα、CREB、CRTC2、PGC1α等表達(dá)均無差異。與HFD-WT組比較,HFD-Nrf2-/-組小鼠肝臟組織p-IR、p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著降低,p-GSK3β、GLUT2、GLUT4、PGC1α蛋白表達(dá)水平無差異,PEPCK、G6Pase和CRTC2表達(dá)水平顯著增加,p-AMPKα蛋白表達(dá)水平顯著降低,p-CREB蛋白表達(dá)水平顯著增加。AMPKα激活后可抵抗棕櫚酸干預(yù)時NRF2缺失導(dǎo)致的糖異生基因表達(dá)增加,AMPKα敲除小鼠原代肝細(xì)胞中NRF2過表達(dá)不能降低糖異生相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)論:高脂飲食誘導(dǎo)時Nrf2基因敲除能降低肝臟的胰島素敏感性,促進(jìn)肝臟糖異生關(guān)鍵基因表達(dá),而Nrf2對肝糖異生的調(diào)控作用依賴于AMPKα。高脂飲食誘導(dǎo)時Nrf2基因敲除能升高肝臟膽固醇合成和外排、脂肪酸合成、脂肪酸攝取和脂肪酸β-氧化相關(guān)關(guān)鍵基因表達(dá)。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R575
【部分圖文】：

圖 1.1 高脂飲食喂養(yǎng) C57 小鼠肝臟 中 Nrf2 的表達(dá)Fig 1.1 Expression of Nrf2 in liver of C57 mice fed with high fat diet (A: Nrf2 mRNAexpression; B: NRF2 protein expression). ** P＜0.01 vs ND-WT.圖 1.2 db/db 小鼠肝臟 中 Nrf2 的表達(dá)

32圖 1.2 db/db 小鼠肝臟 中 Nrf2 的表達(dá)Fig 1.2 Expression of Nrf2 in liver of db/db mice (A: Nrf2 mRNA expression; B: NRF2protein expression). ** P＜0.01 vs db/m.2.2 NRF2 在 NAFLD 病人中表達(dá)升高我們獲取 NAFLD 病人肝臟組織后進(jìn)行 Nrf2 mRNA 和蛋白質(zhì)的檢測，發(fā)現(xiàn)在 NAFLD 病人肝臟組織中 Nrf2 的表達(dá)較正常對照組明顯增加（圖 1.3）

圖 1.3 NAFLD 病人肝臟 中 Nrf2 的表達(dá)Fig 1.3 Expression of Nrf2 in liver of NAFLD patients (A. Nrf2 mRNA expression B.NRF2 protein expression). ** P＜0.01 vs normal individuals.2.3 NRF2 在 NAFLD、胰島素抵抗細(xì)胞模型中表達(dá)升高棕櫚酸造 NAFLD、胰島素抵抗細(xì)胞模型是很常用的方法，參考文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)不同研究使用棕櫚酸濃度不同，而干預(yù)時間基本為 24h，因此我們應(yīng)用不同濃度的棕櫚酸處理 HepG2 細(xì)胞，根據(jù)文獻(xiàn)檢測糖異生基因 PEPCK 和 G6Pase 確定造 NAFLD、胰島素抵抗模型的濃度。結(jié)果顯示使用棕櫚酸終濃度 0.75mM時 PEPCK 和 G6Pase 的 mRNA 表達(dá)顯著升高（圖 1.4），并且在實(shí)驗(yàn)過程中觀察到細(xì)胞狀態(tài)較低濃度時沒有明顯改變，因此后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)采用棕櫚酸0.75mM 終濃度造 NAFLD、胰島素抵抗細(xì)胞模型。如圖 1.5，NRF2 的 mRNA
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 張亞麗;新基因KLF14過表達(dá)影響肝糖代謝及胰島素抵抗的機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2013年

本文編號：2842621