乙型肝炎病毒(HBV)載體是近幾年新發(fā)展的一種病毒載體,不僅具有天然嗜肝特異性,而且具備改造為肝靶向性基因治療載體的基本條件。主要包括:在肝細(xì)胞內(nèi)持續(xù)復(fù)制、反復(fù)感染,病毒本身對(duì)細(xì)胞沒有明顯的細(xì)胞毒性;能夠攜帶外源基因并被包裝成病毒顆粒;能夠介導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)移和表達(dá);但由于基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜,目前改造的HBV載體均存在載容量小、復(fù)制包裝效率低及安全性差等缺點(diǎn),而且HBV載體制備困難,感染效率低,為解決目前存在的困難,有必要使其與其他病毒載體聯(lián)合應(yīng)用。如與腺病毒載體、慢病毒載體、桿狀病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體聯(lián)合應(yīng)用,實(shí)現(xiàn)高載容量、高轉(zhuǎn)染效率、高復(fù)制能力,充分發(fā)揮HBV載體嗜肝導(dǎo)向性,可以利用體內(nèi)野生型HBV為之提供包裝,在體內(nèi)形成具有抗HBV作用的HBV樣顆粒,或攜帶治療性目的基因,進(jìn)一步感染其他肝細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)放大效應(yīng)。因此,通過病毒載體之間的重組,拓寬了HBV載體應(yīng)用領(lǐng)域,不僅有望用于抗HBV基因治療,也可以用于制備DNA疫苗、篩選抗病毒藥物或通過攜帶外源性標(biāo)志基因用于HBV分子生物學(xué)研究等。本研究通過構(gòu)建新型的HBV載體表達(dá)不同的目的基因,構(gòu)建了持續(xù)分泌表達(dá)BsdR重組HBV的的細(xì)胞系,用于HBV的分子生物學(xué)研究或篩選HBV易感細(xì)胞系;或與腺病毒載體聯(lián)合構(gòu)建了表達(dá)MMP8等目的基因的質(zhì)粒,用于抗肝硬化的基因治療,為HBV的分子生物學(xué)研究和肝硬化的生物治療等開辟了新途徑。本研究共分3部分完成。 第一部分新型HBV載體的構(gòu)建 目的應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)改造HBV載體,阻斷其結(jié)構(gòu)基因的表達(dá),提高HBV載體作為基因治療載體的安全性,使其更適用于作為基因治療載體。 方法: 1 pCH-M5-GFP質(zhì)粒的構(gòu)建通過改變pCH-S-GFP的起始密碼子或添加終止密碼子,刪除了HBV質(zhì)粒中Core、HBV-DNAP、pre-S1、pre-S2、S and X等結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá),構(gòu)建pCH-M5-GFP質(zhì)粒。 2 pCH-S-hRLuc和pCH-M5-hRLuc的構(gòu)建在pCH-S-GFP和pCH-M5-GFP質(zhì)粒S基因區(qū),以hRLuc替換GFP,構(gòu)建pCH-S-hRLuc和pCH-M5-hRLuc兩個(gè)質(zhì)粒。 3外源基因的表達(dá)能力的檢測(cè)HBV載體經(jīng)基因改造后,通過質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞,應(yīng)用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá),應(yīng)用熒光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)海腎熒光素酶的表達(dá)水平,鑒定新構(gòu)建質(zhì)粒pCH-M5-GFP、pCH-S-hrLuc和pCH-M5-hrLuc的外源基因的表達(dá)能力。 4重組HBV復(fù)制能力的檢測(cè)。與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后,提取細(xì)胞裂解液中的HBVDNA,Sorthern blot技術(shù)檢測(cè)重組HBV復(fù)制能力。 5重組HBV感染樹鼩肝細(xì)胞能力的檢測(cè)。原代培養(yǎng)樹鼩肝細(xì)胞,感染濃縮的重組HBV顆粒1W后,觀察細(xì)胞內(nèi)GFP的表達(dá)水平。 結(jié)果: 1成功構(gòu)建了不能表達(dá)HBV結(jié)構(gòu)基因的新型HBV載體。 2新型HBV載體外源基因的表達(dá)水平基因突變后表達(dá)GFP的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系后,GFP表達(dá)水平明顯強(qiáng)于原始質(zhì)粒。 3通過southern blot檢測(cè),在細(xì)胞裂解液中能夠形成HBV復(fù)制中間體。 4重組HBV感染樹鼩肝細(xì)胞1W后,能夠觀察到GFP。 結(jié)論:HBV載體通過變更起始密碼子和終止密碼子后,阻斷結(jié)構(gòu)基因表達(dá),在S基因區(qū)插入報(bào)告基因GFP和hrLUC,構(gòu)建了新質(zhì)粒,其外源基因的表達(dá)水平高于對(duì)照原始載體質(zhì)粒,能夠形成HBV DNA復(fù)制中間體,而且形成的重組HBV能夠感染樹鼩肝細(xì)胞。 第二部分新型HBV載體應(yīng)用一:持續(xù)分泌表達(dá)BsdR的重組HBV細(xì)胞系的構(gòu)建 目的: 構(gòu)建一個(gè)持續(xù)分泌重組HBV的細(xì)胞系,該重組HBV表達(dá)殺稻瘟菌素抗性基因(BsdR)。 方法: 1構(gòu)建具有G418抗性的無包裝信號(hào)的HBV輔助質(zhì)粒pcDNA3.1-CH3142與表達(dá)BsdR的HBV載體質(zhì)粒。 2上述2個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,經(jīng)G418和殺稻瘟菌素共篩選,獲得陽性細(xì)胞克隆。 3經(jīng)過ELISA和斑點(diǎn)雜交技術(shù)篩選出高分泌重組HBV-Bsd顆粒的細(xì)胞系。 4 G418反復(fù)加壓培養(yǎng),Southern blot和Native Western blot技術(shù),再次篩選,獲得高表達(dá)Bsd的重組HBV的細(xì)胞系,并通過PCR技術(shù)檢測(cè)重組HBV的表達(dá)水平。 5應(yīng)用PCR技術(shù),對(duì)野生型HBV和重組HBV進(jìn)行鑒定,證實(shí)所構(gòu)建細(xì)胞系無野生型HBV形成。 6應(yīng)用免疫電鏡技術(shù)觀察到完整的有囊膜包被的重組HBV顆粒。 結(jié)果: 1轉(zhuǎn)染后,經(jīng)G418篩選后,獲得50余個(gè)細(xì)胞克隆。 2挑選其中36個(gè)進(jìn)行擴(kuò)增,經(jīng)同位素標(biāo)記探針斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)細(xì)胞上清液中HBV DNA,選取9個(gè)表達(dá)量較高者。 3繼續(xù)傳代培養(yǎng)15代(約3個(gè)月),檢測(cè)其形成疏松環(huán)狀DNA的能力,最終選定HBV-Bsd25,HBV-Bsd7,HBV-Bsd27三個(gè)細(xì)胞株。 4細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBV DNA定量分別為4.1×106、3.6×106、1.2×106copies/mL。 5未檢測(cè)到野生型HBV的產(chǎn)生。 6 HBV-Bsd25細(xì)胞培養(yǎng)上清液經(jīng)PEG8000濃縮后進(jìn)行氯化銫密度梯度離心,分段進(jìn)行Southern Blot及Western Blot檢測(cè),觀察到完整有囊膜包被的重組HBV顆粒形成。 7電鏡觀察有完整的HBV顆粒。 結(jié)論:成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)BsdR重組HBV的細(xì)胞系,實(shí)現(xiàn)了大量制備重組HBV載體,有助于HBV載體用于HBV易感細(xì)胞系的篩選。 第三部分新型HBV載體質(zhì)粒應(yīng)用二:腺病毒-HBV嵌合載體表達(dá)膠原酶II抗肝硬化研究 一、腺病毒-HBV嵌合載體的構(gòu)建與表達(dá) 目的構(gòu)建表達(dá)MMP8、tMMP8、RFP2的HBV載體,再利用復(fù)制缺損型腺病毒載體進(jìn)行包裝,構(gòu)建Ad-CH-tMMP8、Ad-C-MMP8、Ad-CH-RFP2三個(gè)質(zhì)粒。觀察細(xì)胞內(nèi)tMMP8 mRNA和RFP的表達(dá)情況,證明目的基因的表達(dá)能力,及其啟動(dòng)子的嗜肝特異性。 方法: 1應(yīng)用PCR技術(shù)和酶切重組技術(shù)構(gòu)建表達(dá)MMP8、tMMP8、RFP2的HBV載體,經(jīng)過酶切鑒定和測(cè)序鑒定正確后,再利用復(fù)制缺損型腺病毒載體進(jìn)行包裝,構(gòu)建Ad-CH-tMMP8、Ad-C-MMP8、Ad-CH-RFP2三個(gè)質(zhì)粒。 2 PCR技術(shù)證實(shí)重組腺病毒載體正確性,獲得理想基因片段。 3正確后,進(jìn)行大量提取,純化,濃度測(cè)定,感染293細(xì)胞,進(jìn)行空斑形成能力的檢測(cè)。 4肝細(xì)胞感染重組腺病毒后,觀察細(xì)胞內(nèi)MMP8及tMMP8 mRNA的表達(dá)情況,應(yīng)用熒光顯微鏡RFP的表達(dá)情況. 5 HBV載體在血管上皮細(xì)胞(ECV304)中低表達(dá):以CMV啟動(dòng)子及HBVS啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染血管上皮細(xì)胞及肝癌細(xì)胞,分別觀察其GFP的表達(dá)。 結(jié)果: 1成功構(gòu)建了表達(dá)不同目的基因的腺病毒-HBV嵌合載體質(zhì)粒。 2攜帶MMP8和tMMP8的重組腺病毒感染肝細(xì)胞后表達(dá)tMMP8。攜帶RFP2的重組腺病毒感染肝細(xì)胞后表達(dá)紅色熒光。 3不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞后,在HepG2和ECV304的表達(dá)水平存在差異。 結(jié)論:表達(dá)不同目的基因的腺病毒載體-HBV嵌合載體能夠被成功構(gòu)建。該載體轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后,能夠成功表達(dá)各種目的基因;重組腺病毒載體攜帶MMP8基因的質(zhì)粒感染HepG2后,其細(xì)胞中存在MMP8 mRNA的表達(dá),應(yīng)用熒光顯微鏡可以觀察到紅色熒光蛋白;HBV載體s啟動(dòng)子驅(qū)使的GFP在ECV304中低表達(dá),在HepG2呈現(xiàn)高表達(dá)。而CMV啟動(dòng)子驅(qū)使的GFP在ECV304和HepG2均呈現(xiàn)高表達(dá),提示S啟動(dòng)子的載體質(zhì)粒對(duì)肝癌細(xì)胞系有一定特異性。 二、硫代乙酰胺誘導(dǎo)的大鼠肝硬化模型的實(shí)驗(yàn)研究 目的觀察TAA制備大鼠肝硬化模型前后,肝臟組織學(xué)及血清學(xué)指標(biāo)的變化情況,HGF/C-met系統(tǒng)在肝硬化發(fā)生和轉(zhuǎn)歸過程中的表達(dá)水平,為腺病病毒-HBV前忽而載體表達(dá)膠原酶II在肝硬化的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。 方法: 42只雄性Wistar大鼠應(yīng)用硫代乙酰胺飲用水喂養(yǎng),制備肝硬化模型。模型制備成功后,隨機(jī)分為7組,每組6只。每隔2周處死一組大鼠,留取血清檢測(cè)肝功能,并檢測(cè)肝組織中羥脯氨酸含量,進(jìn)行HE和天狼猩紅染色,同時(shí)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)HGF及其受體c-Met,另以正常大鼠6只為對(duì)照。 結(jié)果:HGF/c-Met mRNA表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組,隨著停止應(yīng)用TAA時(shí)間的延長,肝功能、組織學(xué)改變、羥脯氨酸含量及HGF/c-Met的mRNA表達(dá)水平均逐漸恢復(fù)。 結(jié)論:應(yīng)用TAA20周成功誘導(dǎo)了肝硬化模型;停止TAA后,肝組織學(xué)、肝功能和肝臟的羥脯氨酸均有不同程度的自愈趨勢(shì)。肝臟組織學(xué)的好轉(zhuǎn)晚于肝功能的變化。在肝組織自愈的的同時(shí),HGF及其受體c-Met的表達(dá)水平均有不同程度的下降趨勢(shì),但各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 三、腺病毒-HBV嵌合載體表達(dá)膠原酶Ⅱ治療肝硬化的實(shí)驗(yàn)研究 目的通過利用腺病毒-HBV嵌合載體,表達(dá)膠原酶Ⅱ,治療肝硬化大鼠模型,探討其能否有效地降解Ⅰ型膠原,促進(jìn)肝細(xì)胞再生,改善肝功能,逆轉(zhuǎn)肝硬化。 方法: 1模型制備應(yīng)用0.3%硫代乙酰胺飲用水誘導(dǎo)的方法,制備大鼠肝硬化模型。 2分組給藥120只肝硬化模型大鼠隨機(jī)分四組,每組30只,分別給予Ad-CH-tMMP8、Ad-C-MMP8、Ad-CH-RFP2三種重組腺病毒尾靜脈注射,以1.5×1011VP/Kg劑量,一次給藥。另外留取30只大鼠作為正常對(duì)照組,給予正常應(yīng)用水喂養(yǎng)。 3標(biāo)本留取分別于2W、4W、8W后頸椎脫髓法處死動(dòng)物。分離血清,-20℃保存;留取肝組織,少部分用10%的福爾馬林固定,進(jìn)行組織病理學(xué)檢查,余者無菌條件下保存在液氮中。 4指標(biāo)檢測(cè)全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝功能、放射免疫法檢測(cè)肝硬化指標(biāo)。胃酸酶解法檢測(cè)肝組織羥脯氨酸含量。HE、天狼星紅染色、免疫組化的方法觀察肝臟組織病理學(xué)改變,并進(jìn)行Knodel評(píng)分和一型膠原所占面積百分比進(jìn)行半定量分析。RT-PCR方法檢測(cè)肝組織內(nèi)MMP8、HGF、c-Met和GAPDH。 5統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SAS統(tǒng)計(jì)分析軟件,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。 結(jié)果: 1 Ad-HBV嵌合載體對(duì)肝硬化大鼠模型MMP8 mRNA表達(dá)水平的影響治療組大鼠肝臟能夠表達(dá)MMP8,但對(duì)照組沒有檢測(cè)到MMP8 mRNA表達(dá),而且隨著停藥時(shí)間的延長,其表達(dá)水平呈下降趨勢(shì),直到第12W仍有少量表達(dá)。 2 Ad-HBV嵌合體對(duì)肝硬化大鼠模型肝功能的影響在第2W、第4W時(shí),與兩個(gè)對(duì)照組相比,各治療組ALT均有明顯下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。第8周,治療組肝功能接近正常組。 3 Ad-HBV嵌合體對(duì)肝硬化大鼠模型肝纖維化指標(biāo)的影響與兩個(gè)對(duì)照組相比,各治療組HA和LN均有明顯下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。在治療第8W時(shí),治療組HA和LN接近正常組。 4 Ad-HBV嵌合體對(duì)大鼠肝硬化模型肝組織學(xué)的影響與對(duì)照組相比,治療組病理學(xué)改善較快,炎癥細(xì)胞浸潤及纖維組織增生明顯減輕,肝小葉結(jié)構(gòu)破壞減輕,有肝細(xì)胞再生現(xiàn)象。 5 Ad-HBV嵌合體對(duì)大鼠肝硬化模型肝組織羥脯氨酸含量的影響羥脯氨酸是膠原和彈性蛋白水解后產(chǎn)生的的一種氨基酸,約占膠原重量14%,其他蛋白質(zhì)中罕見。羥脯氨酸的含量也隨著肝硬化的嚴(yán)重程度而改變,在應(yīng)用腺病毒治療2W時(shí),肝組織內(nèi)羥脯氨酸含量明顯低于對(duì)照組。 6 Ad-HBV嵌合體在大鼠肝硬化模型HGF/c-Met mRNA的表達(dá)與兩個(gè)對(duì)照組相比,各治療組HGF/cMet mRNA均有明顯升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。第8周,治療組肝組織HGF/c-Met mRNA接近正常組。 結(jié)論: 應(yīng)用重組腺病毒治療大鼠肝硬化模型后,肝功能好轉(zhuǎn),肝組織學(xué)及肝組織內(nèi)的羥脯胺酸明顯改善,肝組織表達(dá)MMP8,能夠有效地降解Ⅰ型膠原,肝硬化減輕,肝細(xì)胞再生。HGF/c-Met mRNA表達(dá)水平增加。這一創(chuàng)新,有望把MMP-8基因治療肝硬化帶入臨床應(yīng)用,開辟肝硬化軟肝治療新途徑。
【學(xué)位單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R512.6
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
英文縮寫
研究論文 新型乙型肝炎病毒載體的構(gòu)建與初步應(yīng)用實(shí)驗(yàn)研究
    引言
    第一部分 新型乙型肝炎病毒載體的構(gòu)建
        前言
        材料與方法
        結(jié)果
        附圖
        討論
        小結(jié)
        參考文獻(xiàn)
    第二部分 HBV 載體應(yīng)用一：表達(dá)BsdR 的復(fù)制缺損型HBV 載體的穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建
        前言
        材料與方法
        結(jié)果
        附圖
        討論
        小結(jié)
        參考文獻(xiàn)
    第三部分 HBV 載體應(yīng)用二：腺病毒-HBV 嵌合載體表達(dá)膠原酶II抗肝硬化研究
        一、腺病毒-HBV 嵌合載體的構(gòu)建與表達(dá)
            前言
            材料與方法
            結(jié)果
            附圖
            討論
            小結(jié)
            參考文獻(xiàn)
        二、硫代乙酰胺誘導(dǎo)大鼠肝硬化模型的實(shí)驗(yàn)研究
            前言
            材料與方法
            結(jié)果
            附圖
            討論
            小結(jié)
            參考文獻(xiàn)
        三、腺病毒-HBV 嵌合載體表達(dá)膠原酶2 治療肝硬化的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究
            前言
            材料與方法
            結(jié)果
            附圖
            附表
            討論
            小結(jié)
            參考文獻(xiàn)
    結(jié)論
綜述一 乙型肝炎病毒載體的研究進(jìn)展
綜述二 肝纖維化的生物治療
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)歷

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2839540