肝纖維化(Liver fibrosis)主要由病毒感染、酒精中毒等多種因素引起的慢性肝損傷。肝星狀細胞(Hepatic stellate cells,HSCs)參與肝纖維化的起始、進展和消退過程,靜止的肝星狀細胞(Q-HSCs)具有上皮細胞和脂肪細胞特征,其向肌成纖維細胞(MF-HSCs)的轉分化是肝纖維化的關鍵環(huán)節(jié),而上皮間質轉化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)參與該環(huán)節(jié)。EMT是細胞失去上皮表型和基因表達特征,轉變?yōu)殚g質細胞的過程。多數研究表明,在各器官中肌成纖維細胞是通過EMT產生,以應對各種慢性損傷,該過程在一定條件作用下可發(fā)生逆轉。近年研究表明二甲雙胍(metformin,Met)有廣泛的藥理作用,各種藥理機制中包括抑制EMT過程。同時已有實驗證明二甲雙胍可在一定程度緩解肝纖維化,其可以通過作用HSCs到達逆轉肝纖維化目的。因此,二甲雙胍可能通過逆轉EMT過程起到抑制肝纖維化的作用,進一步對肝纖維化逆轉機制的認識,有望為肝纖維化治療提供新的理論依據。目的研究二甲雙胍對小鼠肝纖維化及其上皮間質轉化相關蛋白表達的影響及二甲雙胍是否通過調控上皮間質轉化抑制肝星狀細胞的活化方法1、將45只4周齡的小鼠隨機分為3組,每組15只,即正常組、模型組(CCl_4組)、CCl_4+二甲雙胍治療組(CCl_4+Met組);模型組給予橄欖油、CCl_4混合物處理,按1:3比例,經腹腔注射,2次/周,劑量為0.4 ml/kg;正常組給予相同容量橄欖油,腹腔注射,2次/周,劑量為0.4 ml/kg;二甲雙胍治療組造模方法同模型組。從第3周開始,通過灌胃給予二甲雙胍治療,200 mg/次,1次/天;正常組和模型組通過灌胃給予生理鹽水,200 mg/次,1次/天,至造模第6周處死小鼠,取肝臟組織。計算小鼠的肝臟指數,檢測肝功能相關指標ALT、AST含量,進行HE和天狼猩紅染色觀察小鼠肝臟病理學改變。通過Western blot和RT-PCR檢測肝纖維化相關蛋白α-平滑肌激動蛋白(α-SMA)和Ⅰ型膠原蛋白(CollagenⅠ)含量,EMT相關蛋白上皮標志物如E-cadherin;間質標記物如vimentin、N-cadherin、Twist的表達。通過Image J軟件對蛋白表達量進行分析。2、將對數生長期的LX-2細胞,用0.25%的胰蛋白酶消化制成細胞懸液,接種于12個培養(yǎng)皿中,平均分為四組即空白對照組、TGF-β1組、TGF-β1+Met低劑量組、TGF-β1+Met高劑量組�？瞻讓φ战M不做處理;TGF-β1組給予10ng/ml的細胞因子TGF-β1誘導細胞活化;TGF-β1+Met低劑量組給予10 ng/ml的細胞因子TGF-β1和5 mmol/ml的二甲雙胍;TGF-β1+Met高劑量組給予10 ng/ml的細胞因子TGF-β1和10 mmol/ml的二甲雙胍。通過油紅O染色了解細胞狀態(tài),通過免疫熒光、克隆形成實驗、劃痕實驗、Transwell侵襲實驗檢測細胞活化、增殖、遷移能力,通過Western blot和RT-PCR檢測細胞活化相關蛋白α-SMA的表達和EMT相關蛋白上皮標志物如E-cadherin;間質標記物如vimentin、N-cadherin及Twist的表達,并通過Image J軟件對蛋白表達量進行分析。結果1、與正常組比較,CCl_4組肝臟指數明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.01);與CCl_4組比較,CCl_4+Met組肝臟指數一定程度降低,但高于正常組,差異顯著,有統(tǒng)計學意義(p0.01)。CCl_4組小鼠的肝臟功能相關指標AST、ALT較正常組明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.01);與CCl_4組相比,CCl_4+Met組小鼠AST、ALT含量明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(p0.01)。正常小鼠肝臟組織無明顯變化;與正常組比較,CCl_4組小鼠匯管區(qū)內出現(xiàn)粗大的膠原纖維條索分割包繞,纖維間隔明顯增厚,肝小葉結構明顯異常,有假小葉形成,肝細胞索排列紊亂,間質內炎性細胞浸潤明顯,出現(xiàn)大量膠原沉積,分布廣泛,在匯管區(qū)間分布較多,α-SMA和CollagenⅠ表達明顯增高;與CCl_4組相比,CCl_4+Met治療組,膠原纖維的增生減輕,假小葉的形成改善,炎性細胞浸潤程度減輕,僅有部分膠原增生,肝小葉中可見少量間隔形成,α-SMA和CollagenⅠ表達減少。WB、RT-PCR結果顯示:CCl_4組小鼠肝臟內α-SMA和CollagenⅠ蛋白表達明顯升高;與CCl_4組比較,CCl_4+Met組小鼠肝臟α-SMA和CollagenⅠ蛋白表達顯著減少。CCl_4組小鼠肝臟內上皮標志物E-cadherin表達明顯減少,間質標志物vimentin、N-cadherin和Twist表達明顯增多;與CCl_4組比較,CCl_4+Met組小鼠肝臟內E-cadherin表達明顯增加,間質標志物vimentin、N-cadherin和Twist表達明顯減少。2、與空白對照組比較,TGF-β1組細胞活化程度、增殖能力明顯升高、遷移能力增加;給予Met干預后細胞增殖能力下降、遷移能力下降,有一定程度的濃度依賴性。WB和RT-PCR實驗結果顯示:與空白對照組比較,TGF-β1組α-SMA表達明顯升高;Met干預后α-SMA表達減少,有一定程度的濃度依賴性。同時,空白對照組細胞內上皮標志物表達較多,間質標志物少量表達;與空白對照組比較,TGF-β1組上皮標志物E-cadherin表達明顯減少,間質標志物vimentin、N-cadherin和Twist表達明顯增多;Met干預后上皮標志物表達增加,間質標志物表達減少,有一定程度的濃度依賴性。結論(1)腹腔注射CCl_4后,肝功能指標升高,肝纖維化相關α-SMA和CollagenⅠ蛋白表達明顯升高,EMT相關蛋白表達升高;(2)二甲雙胍可改善肝臟纖維化,使α-SMA和CollagenⅠ的表達明顯下調;(3)二甲雙胍改善肝纖維化病變程度的同時,抑制肝臟EMT相關蛋白的表達;(4)TGF-β1誘導HSCs的活化,同時促進細胞EMT相關蛋白表達;(5)二甲雙胍可抑制活化HSCs的EMT相關蛋白表達,且呈濃度依賴性;(6)在二甲雙胍作用下,HSCs的活化、增殖和遷移能力明顯下降,且呈濃度依賴性。
【學位單位】：成都醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R575.2
【部分圖文】：

第一部分 二甲雙胍對小鼠肝纖維化及其上皮間質轉化相關蛋白表達的影響果指數及肝功能變化指數數的變化可間接反映出小鼠肝纖維化發(fā)生過程肝臟大體標驗結果得出，與空白組比較，CCl4組肝臟指數明顯升高，義（p<0.01）；與 CCl4組比較，CCl4+Met 組肝臟指數一組高，差異顯著，有統(tǒng)計學意義（p<0.01）（圖 1-1）。

圖 1-2 血清中 ALT、AST 含量Figure 1-2 Contents of ALT and AST in serum4.2 各組小鼠肝臟組織病理染色及結果分析4.2.1 肝臟 HE 染色正常小鼠肝臟內肝小葉正常，肝細胞索整齊排列，間質內無炎性細胞與正常組比較，CCl4組小鼠匯管區(qū)內出現(xiàn)粗大的膠原纖維條索分割包繞，隔明顯增厚，肝小葉結構明顯異常，有假小葉形成，肝細胞索排列紊亂，炎性細胞浸潤明顯；與 CCl4組相比，CCl4+Met 治療組，膠原纖維的增生減小葉的形成改善，炎性細胞浸潤程度減輕（圖 1-3）。

圖 1-2 血清中 ALT、AST 含量Figure 1-2 Contents of ALT and AST in serum4.2 各組小鼠肝臟組織病理染色及結果分析4.2.1 肝臟 HE 染色正常小鼠肝臟內肝小葉正常，肝細胞索整齊排列，間質內無炎性細胞浸潤；與正常組比較，CCl4組小鼠匯管區(qū)內出現(xiàn)粗大的膠原纖維條索分割包繞，纖維間隔明顯增厚，肝小葉結構明顯異常，有假小葉形成，肝細胞索排列紊亂，間質內炎性細胞浸潤明顯；與 CCl4組相比，CCl4+Met 治療組，膠原纖維的增生減輕，假小葉的形成改善，炎性細胞浸潤程度減輕（圖 1-3）。
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本文編號：2837318