發(fā)布時(shí)間：2020-10-10 22:27

　　 目的:研究沉默信息調(diào)節(jié)蛋白(Sirtuin)家族成員之一SIRT-6是否可以通過調(diào)控脂質(zhì)代謝及肝細(xì)胞衰老過程以改善非酒精性脂肪性肝病,并探討其具體的分子機(jī)制。方法:(1)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為如下幾組:4周普通飲食組(4w CD,n=5)、22周普通飲食組(22w CD,n=10)、22周高脂飲食組(22w HF,n=22)、22周高脂飲食合并SIRT-6過表達(dá)組及陰性對照組(末兩周尾靜脈注射SIRT-6過表達(dá)慢病毒及陰性對照病毒,分別命名22w HF+LV Sirt6、22w HF+LV NC,各n=4)。取各組肝組織進(jìn)行HE染色、油紅O染色等分析。RT-PCR檢測各組SIRT-6、脂肪酸b氧化指標(biāo)PPAR-a、脂質(zhì)合成指標(biāo)(PPAR-g、SCD-1)、衰老相關(guān)分泌表型指標(biāo)(IL-6、CCL-8、HGF)、衰老指示物GLB-1及細(xì)胞周期指示物(MCM-2、P21)的m RNA表達(dá)。心臟取血,通過全自動生化分析儀檢測各組血清AST、ALT含量。(2)體外實(shí)驗(yàn)。采用小鼠肝細(xì)胞系A(chǔ)ML-12研究。向AML-12細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染SIRT-6過表達(dá)慢病毒及其陰性對照病毒、SIRT-6干擾質(zhì)粒及其陰性對照質(zhì)粒,在300m(44)PA或常規(guī)條件下培養(yǎng)24h。油紅O染色檢測各組脂滴沉積情況;用RT-PCR、Western blot或免疫熒光檢測各組細(xì)胞SIRT-6、PPAR-a、PPAR-g、SCD-1、ACADM、CPT1a、IL-6、CCL-8、HGF、GLB-1、MCM-2、P21、g-H2AX的表達(dá)。(3)探討SIRT-6上調(diào)PPAR-a的分子機(jī)制。(1)分別用SIRT-6去乙�；父咝Ъせ顒┗ㄇ嗨�100m(44)、高效抑制劑兒茶素10m(44)干預(yù)常規(guī)培養(yǎng)或300m(44)PA培養(yǎng)條件下的AML-12細(xì)胞24h,Western blot檢測各組PPAR-a的表達(dá)情況。(2)應(yīng)用熒光素酶報(bào)告基因法檢測常規(guī)培養(yǎng)及300m(44)PA培養(yǎng)條件下SIRT-6對PPAR-a啟動子活性的調(diào)控作用,計(jì)算各組標(biāo)準(zhǔn)化相對熒光素酶活性倍數(shù)。結(jié)果:(1)體內(nèi)實(shí)驗(yàn):(1)HE及油紅O染色提示22w HF組小鼠肝組織出現(xiàn)明顯的大泡脂滴沉積,而22w HF+LV Sirt6組脂滴沉積顯著減少;(2)RT-PCR提示4w CD、22w CD、22w HF組肝組織SIRT-6、MCM-2表達(dá)逐級下調(diào)(P0.05),IL-6、CCL-8、HGF、P21表達(dá)均逐級上調(diào);相較于22w CD組,22w HF組PPAR-?表達(dá)下調(diào),PPAR-?、SCD-1表達(dá)均上調(diào)(P0.05);與22w HF+LV NC組相比,22w HF+LV Sirt6組肝組織IL-6、CCL-8、HGF、GLB-1、P21表達(dá)均下調(diào),PPAR-?表達(dá)上調(diào)(P0.05),PPAR-?、SCD-1表達(dá)無明顯變化。(3)22w HF組小鼠血清AST、ALT水平顯著升高(P0.05),而22w HF+LV Sirt6組AST、ALT水平與之相比下降(P0.05)。(2)體外實(shí)驗(yàn):(1)油紅O染色提示PA干預(yù)組細(xì)胞有明顯脂滴沉積。當(dāng)SIRT-6過表達(dá)時(shí),脂滴沉積減輕。(2)RT-PCR、Western blot或免疫熒光提示PA干預(yù)組SIRT-6、PPAR-?、ACADM、CPT1a、MCM-2表達(dá)下調(diào),PPAR-?、SCD-1、IL-6、CCL-8、HGF、GLB-1、P21、?-H2AX表達(dá)上調(diào);與之相比當(dāng)SIRT-6過表達(dá)時(shí),除了PPAR-?、SCD-1,其他指標(biāo)均逆轉(zhuǎn)(P0.05);當(dāng)SIRT-6沉默時(shí),GLB-1表達(dá)上調(diào)(P0.05),PPAR-?、ACADM、CPT1a表達(dá)下調(diào)(P0.05)。(3)SIRT-6對PPAR-?的調(diào)控機(jī)制:(1)Western blot提示常規(guī)培養(yǎng)條件下花青素和兒茶素對PPAR-?的表達(dá)無影響;而在PA干預(yù)培養(yǎng)條件下兩者可分別使PPAR-?的表達(dá)下調(diào)、上調(diào)(P0.05)。(2)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)提示在常規(guī)培養(yǎng)條件或PA干預(yù)培養(yǎng)條件下,SIRT-6的上調(diào)均可顯著提高PPAR-?的啟動子活性(P0.05)。結(jié)論:(1)SIRT-6改善脂質(zhì)代謝紊亂的主要靶點(diǎn)是通過上調(diào)PPAR-?信號通路的表達(dá)促進(jìn)脂肪酸?氧化;(2)SIRT-6主要通過增強(qiáng)PPAR-?啟動子活性上調(diào)其通路表達(dá);(3)SIRT-6具有同時(shí)調(diào)控脂質(zhì)代謝和阻遏肝細(xì)胞衰老的作用,是NAFLD介導(dǎo)肝細(xì)胞衰老的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R575.5
【部分圖文】：

. 用免疫組織化學(xué)法比較健康對照和慢性肝病病人肝組織 SIRT-6 的表達(dá)情況首先，我們從臨床角度出發(fā)，通過免疫組織化學(xué)法，比較經(jīng)病理學(xué)證實(shí)的健康對者、自身免疫性肝病病人、NAFLD 病人肝組織的 SIRT-6 的表達(dá)情況，以初步了解AFLD 與 SIRT-6 表達(dá)的關(guān)系。SIRT-6 定位于細(xì)胞核，故為核染。健康對照者肝細(xì)胞態(tài)正常，未見脂質(zhì)沉積與炎性細(xì)胞浸潤，SIRT-6 核染明顯，提示 SIRT-6 表達(dá)量較（見圖 1-A）；自身免疫性肝病病人肝組織未見脂質(zhì)沉積，有明顯的淋巴細(xì)胞和漿胞浸潤，SIRT-6 核染輕度減低，提示 SIRT-6 表達(dá)量開始下降（見圖 1-B）；NAFLD人肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯的脂質(zhì)沉積，以大泡性脂肪滴變?yōu)橹�，伴慢性炎性�?xì)胞浸潤。IRT-6 未見核染，提示 SIRT-6 表達(dá)處于更低水平（見圖 1-C）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果為論證IRT-6 參與 NAFLD 發(fā)生發(fā)展提供了臨床基礎(chǔ)，下一步我們將通過基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分 SIRT-6 調(diào)控 NAFLD 脂質(zhì)代謝紊亂與肝細(xì)胞衰老的機(jī)制。此外，本節(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示IRT-6 還可能參與到更多慢性肝病，如自身免疫性肝病的發(fā)生發(fā)展之中。

圖 2 小鼠喂養(yǎng)周期體重變化趨勢與大體形態(tài)與 HF 組小鼠在喂養(yǎng)第 0w、5w、10w、15w、20w 時(shí)的體重及變化趨勢兩組小鼠體重的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05D、22w HF、22w HF+LV-NC、22w HF+LV-Sirt6 四組小鼠的大體形態(tài)（標(biāo)好的實(shí)驗(yàn)方案，普通飲食組小鼠（CD 組）和高脂飲食喂養(yǎng) 20 周。喂養(yǎng)第 0w、5w、10w、15w、20w 時(shí) CD 2.12 1.98）g、（25.65 4.94）g、（28.33 4.06）g、（6）g；HF 組小鼠的體重分別為：（23.11 2.38）g、（20）g、（36.78 3.72）g、（37.91 4.77）g。第 15w、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組小鼠體重變化趨勢如圖 2-A 所示。，從HF組隨機(jī)選取8只小鼠，尾靜脈注射慢病毒。其中4NC。上述各組按照之前的方法繼續(xù)喂養(yǎng) 2 周直至第 22 22w HF、22w HF+LV-NC、22w HF+LV-Sirt6 四組小鼠。

兩種檢測方法均提示 4w CD 組、22w CD 組小鼠的肝組織未見明顯的脂質(zhì)沉積（見圖3-A、-B，圖 4-A、-B）。而 22w HF 組小鼠的肝組織可見到明顯的脂質(zhì)沉積，超過60%的肝細(xì)胞出現(xiàn)大泡性脂滴，提示嚴(yán)重脂肪變性（見圖 3-C、圖 4-C）。22w HF+LV-Sirt6組小鼠的肝組織脂質(zhì)沉積顯著減少，肝細(xì)胞脂肪變性得到明顯改善（見圖 3-D、圖4-D）。本節(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示 SIRT-6 可以減輕 NAFLD 小鼠的脂質(zhì)沉積。圖 3 各組小鼠肝組織 HE 染色（×400）A、B、C、D 分別表示 4w CD、22w CD、22w HF、22w HF+LV-Sirt6 四組小鼠肝組織的 HE 染色圖 4 各組小鼠肝組織油紅 O 染色（×400）A、B、C、D 分別表示 4w CD、22w CD、22w HF、22w HF+LV-Sirt6 四組小鼠肝組織的油紅 O 染色4. 各組小鼠肝組織免疫組織化學(xué)染色用免疫組織化學(xué)的方法檢測各組小鼠肝組織內(nèi) SIRT-6、 -H2AX 的表達(dá)（見圖 5）。SIRT-6 與 -H2AX 定位于細(xì)胞核，故均是核染。4w CD、22w CD、22w HF 三組小鼠肝組織內(nèi) SIRT-6 的表達(dá)逐漸減少，其中 22w HF 組下調(diào)最顯著。相較于 22w HF 組，22w HF+LV-Sirt6 組肝組織內(nèi) SIRT-6 的表達(dá)明顯上調(diào)。4w CD、22w CD、22w HF 三
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本文編號：2835669