背景 潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種累及直腸和結(jié)腸粘膜及粘膜下層的慢性非特異性炎癥性疾病�；颊吲R床癥狀表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、粘液膿血便等,病情輕重不一,多為慢性病程,表現(xiàn)為發(fā)作期與緩解期交替。UC的發(fā)病機(jī)制尚未明確。已有的研究證實(shí)了機(jī)體的固有免疫及適應(yīng)性免疫的異常、遺傳易感因素以及環(huán)境因素共同參與了該病的發(fā)生。 乳汁球微粒表皮生長因子8(MFG-E8)是一種分泌型的糖蛋白,可在多種細(xì)胞中表達(dá),包括巨噬細(xì)胞、乳腺上皮細(xì)胞、表皮角質(zhì)細(xì)胞等。MFG-E8參與了許多重要的細(xì)胞事件。MFG-E8在巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的凋亡細(xì)胞清除中起了重要作用,同時(shí)在乳腺發(fā)育以及精子與卵細(xì)胞的結(jié)合過程中也起了重要作用。 MFG-E8在腸粘膜損傷后修復(fù)以及腸道炎癥調(diào)節(jié)中都起了重要的作用。已有的研究證實(shí)了MFG-E8存在于小鼠腸粘膜固有層的巨噬細(xì)胞中。在盲腸結(jié)扎穿刺誘導(dǎo)的小鼠敗血癥模型中,腸道中的MFG-E8含量明顯下降。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了外源性的重組MFG-E8能夠促進(jìn)其腸上皮細(xì)胞沿著隱窩-絨毛軸移行,從而促進(jìn)腸粘膜損傷后的修復(fù)。在右旋葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型急性期,炎癥累及的結(jié)腸段中MFG-E8的表達(dá)量與正常的結(jié)腸段相比明顯降低。預(yù)先給予小鼠外源性的重組MFG-E8,能明顯減輕DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥,這些表明了MFG-E8在腸道炎癥中起了調(diào)節(jié)作用。最近的一項(xiàng)研究證實(shí)了在DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎恢復(fù)期,給予小鼠重組MFG-E8能加快腸粘膜損傷后的修復(fù),從另一方面有力地證實(shí)了MFG-E8在腸道炎癥治療中的積極作用。盡管許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了MFG-E8在腸道炎癥及損傷修復(fù)中的重要作用,迄今為止尚未有關(guān)于人類腸道中MFG-E8研究的報(bào)道。同時(shí)UC患者中MFG-E8表達(dá)情況的研究也是缺失的。鑒于MFG-E8在腸道炎癥及腸粘膜損傷修復(fù)中的重要作用,我們推測UC患者腸粘膜中MFG-E8的含量可能存在異常。所以我們本次研究的目的在于揭示MFG-E8在正常人及UC患者腸粘膜中的表達(dá)情況,同時(shí)分析UC患者腸粘膜中MFG-E8含量與患者疾病嚴(yán)重程度以及腸粘膜炎癥分級的關(guān)系。 目的 1.研究MFG-E8在正常人及UC患者腸粘膜中的表達(dá)情況。 2.分析UC患者腸粘膜中MFG-E8含量與腸粘膜炎癥程度以及患者疾病活動(dòng)指數(shù)的相關(guān)性。 方法 1.研究對象及標(biāo)本采集 本研究入選了26例UC患者及26例對照者。26例UC患者為監(jiān)測病情而來山東大學(xué)齊魯醫(yī)院消化內(nèi)鏡中心進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查,其診斷依據(jù)我國已有的臨床、內(nèi)鏡及病理診斷標(biāo)準(zhǔn)。對照者選用來我院行結(jié)腸鏡檢查的內(nèi)鏡下腸粘膜無異常者,這些對照者中包括息肉切除術(shù)后復(fù)查者、腸道功能性疾病如腸易激綜合征的患者,也有部分為查體而行結(jié)腸鏡檢查。本研究方案經(jīng)山東大學(xué)齊魯醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施,所有的受試對象均被提前告知實(shí)驗(yàn)過程,并親自簽署了知情同意書。 對于UC患者,腸粘膜標(biāo)本取自內(nèi)鏡下炎癥明顯的部位。正常對照者標(biāo)本取自內(nèi)鏡下正常的腸粘膜。所有的標(biāo)本均取自直腸或者乙狀結(jié)腸。每例研究對象從同 部位取2塊臨近的標(biāo)本,1塊用于行組織學(xué)分析,另外1塊用于RNA或總蛋白提取。 2.腸粘膜標(biāo)本炎癥程度分級及UC患者的疾病活動(dòng)指數(shù)計(jì)算 腸粘膜標(biāo)本的炎癥程度按照Mart's標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級,根據(jù)HE染色結(jié)果顯示的中性粒細(xì)胞浸潤程度劃分為輕度、中度或重度級別。每位UC患者在進(jìn)行腸鏡檢查時(shí)均計(jì)算Mayo疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI,0-12分范圍)。該指數(shù)的計(jì)算基于患者每日的排便次數(shù)、便血情況、內(nèi)鏡下表現(xiàn)以及臨床醫(yī)師對患者的整體評價(jià)。 3.RNA提取、半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR. 總共有25例腸粘膜活檢標(biāo)本用來提取RNA,包括12例來自對照者的正常腸粘膜,13例來自UC患者的病變腸粘膜。RNA的提取應(yīng)用Trizol試劑,采用氯仿萃取及異丙醇沉淀的方法獲得RNA。反轉(zhuǎn)錄應(yīng)用莫羅尼氏鼠白血病毒(M-MLV)來源的逆轉(zhuǎn)錄酶,引物為寡聚脫氧胸腺嘧啶18(oligo-dT18)。普通半定量PCR應(yīng)用ExTaq DNA聚合酶,反應(yīng)在Mastercyler熱循環(huán)儀上進(jìn)行。實(shí)時(shí)熒光定量PCR應(yīng)用SYBR Green試劑,在羅氏Lightcycler2.0機(jī)器上進(jìn)行PCR反應(yīng)。管家基因人beta-actin作為內(nèi)參,實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果采用2-△△CT分析方法。4.蛋白質(zhì)提取及western boltting 總共有27例腸粘膜活檢標(biāo)本用來提取總蛋白,13例為來自對照者的正常腸粘膜,14例為來自UC患者的病變腸粘膜�？偟鞍撞捎肦IPA裂解法,蛋白濃度測定采用BCA法。變性后的總蛋白通過不同濃度的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,室溫下應(yīng)用5%脫脂奶粉封閉后依次孵育一抗以及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗。用ECL化學(xué)發(fā)光法來檢測條帶。 5.組織學(xué)分析 每一例研究對象都有1例腸粘膜活檢標(biāo)本用于組織學(xué)分析。用于組織學(xué)分析的標(biāo)本首先在10%中性福爾馬林緩沖液中固定48h,再行脫水浸蠟。石蠟包埋后,切成3μm厚度的切片。常規(guī)組織病理學(xué)分析采用伊紅-蘇木素染色法。MFG-E8免疫染色應(yīng)用Envision二步法,一抗為小鼠來源的抗人MFG-E8單克隆抗體。 結(jié)果 1.研究對象的基本情況 UC患者(26例)與正常對照組(26例)在年齡、性別構(gòu)成方面相匹配。UC患者中有3例潰瘍性直腸炎、14例左半結(jié)腸炎以及7例全結(jié)腸炎患者。 2. MFG-E8在UC患者腸粘膜中的表達(dá)情況 普通半定量PCR結(jié)果證實(shí)了在對照者及UC患者的腸粘膜中均能檢測到MFG-E8mRNA。實(shí)習(xí)熒光定量PCR進(jìn)一步證實(shí)了腸粘膜中MFG-E8mRNA水平在UC患者中明顯低于正常對照者(P0.01)。Western blotting結(jié)果證實(shí)了在UC患者(13例)腸粘膜中MFG-E8蛋白水平明顯低于對照者正常腸粘膜(14例)(P0.01)。 3.MFG-E8表達(dá)量與UC腸粘膜炎癥分級和疾病活動(dòng)指數(shù)的相關(guān)性分析 在腸粘膜中度至重度炎癥的UC患者中MFG-E8蛋白含量下降較之輕度炎癥患者更為明顯,有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。Spearman相關(guān)性分析證實(shí)了MFG-E8蛋白水平與UC患者疾病活動(dòng)指數(shù)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.7713,P0.01)。 4.免疫組化 免疫組化結(jié)果顯示了MFG-E8在人腸粘膜中主要存在于腸上皮細(xì)胞中。在UC患者的腸上皮中,較之對照者正常腸粘膜上皮MFG-E8染色明顯變?nèi)�。腸粘膜間質(zhì)中未見明顯陽性MFG-E8染色。 結(jié)論 1.MFG-E8存在于人腸粘膜之中,由人腸上皮細(xì)胞表達(dá)。 2.潰瘍性結(jié)腸炎患者炎癥累及的腸粘膜組織中MFG-E8mRNA及蛋白表達(dá)水平與正常對照者腸粘膜相比明顯降低。 3.潰瘍性結(jié)腸炎患者腸粘膜組織中MFG-E8含量與粘膜炎癥分級和患者的疾病活動(dòng)指數(shù)均呈負(fù)相關(guān)。 背景 MFG-E8是一種多功能的分泌型糖蛋白,最早發(fā)現(xiàn)其存在于人乳汁球微粒的表面。MFG-E8可在巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、表皮角質(zhì)細(xì)胞及乳腺上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞中表達(dá)。MFG-E8在巨噬細(xì)胞清除凋亡細(xì)胞、精子和卵細(xì)胞結(jié)合以及乳腺的發(fā)育等多種復(fù)雜的細(xì)胞事件中起了重要作用。MFG-E8在腸粘膜損傷后修復(fù)及腸道炎癥調(diào)節(jié)中也起了重要作用。在盲腸結(jié)扎穿刺誘導(dǎo)的小鼠敗血癥模型中,應(yīng)用外源重組的MFG-E8能促進(jìn)小鼠腸上皮細(xì)胞沿隱窩-絨毛軸爬行,從而促進(jìn)損傷后腸粘膜的修復(fù)。在DSS誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的急性期,炎癥累及的結(jié)腸粘膜中MFG-E8的表達(dá)量明顯下調(diào)。預(yù)先給予小鼠外源性重組的MFG-E8可以減輕DSS所導(dǎo)致的結(jié)腸炎癥。體外實(shí)驗(yàn)中,重組的MFG-E8能抑制LPS所誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎性因子TNF-alpha. IL-1beta和IFN-gamma的分泌。MFG-E8能抑制NF-kappa B的活化,從而進(jìn)一步下調(diào)下游炎性介質(zhì)的產(chǎn)生。這些研究都充分肯定了MFG-E8在腸粘膜損傷修復(fù)以及腸道炎癥調(diào)節(jié)中的作用。 我們之前的研究從轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平上證實(shí)了潰瘍性結(jié)腸炎患者病變結(jié)腸粘膜中MFG-E8表達(dá)量較之對照組的正常結(jié)腸粘膜明顯減少。同時(shí),在UC患者中腸粘膜MFG-E8的表達(dá)量與粘膜炎癥分級以及患者的Mayo疾病活動(dòng)指數(shù)均成負(fù)相關(guān)。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色技術(shù),我們首次證實(shí)了MFG-E8存在于人腸粘膜上皮細(xì)胞中。鑒于在正常人腸上皮細(xì)胞中MFG-E8有豐富的表達(dá),同時(shí)UC患者的腸上皮細(xì)胞中MFG-E8表達(dá)量明顯減少,我們推測MFG-E8可能在腸上皮細(xì)胞中參與了重要的生理功能并且在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制起了重要作用。 腸上皮細(xì)胞(IEC)及其之間的緊密連接構(gòu)成的腸粘膜屏障,將機(jī)體內(nèi)環(huán)境與腸腔內(nèi)的細(xì)菌等有害物質(zhì)隔離開,是人體的一道重要生理防護(hù)屏障。正常腸粘膜屏障功能的維持依賴于完整的腸粘膜、腸道的內(nèi)正常菌群、腸道內(nèi)分泌物和蠕動(dòng)以及腸道免疫功能等,其中最基礎(chǔ)的是完整的腸粘膜上皮屏障。UC患者中腸上皮細(xì)胞凋亡率增加,這使得正常腸上皮細(xì)胞的生理周期縮短,加快腸上皮細(xì)胞的脫落,從而引起腸粘膜上皮屏障功能的損害。腸上皮細(xì)胞能夠產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子及趨化因子,這些因子一方面可以直接作用于腸粘膜上皮,引起腸上皮屏障的損傷；另一方面這些炎性因子也可作用于固有層中的單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等,促進(jìn)其分泌更多的炎性因子。潰瘍性結(jié)腸炎為慢性病程,腸粘膜損傷與修復(fù)過程持續(xù)存在。許多促修復(fù)因子參與了腸粘膜損傷修復(fù)的過程中,潰瘍性結(jié)腸炎患者腸粘膜中多種修復(fù)因子存在異常表達(dá)。在這些因子中腸三葉肽及轉(zhuǎn)化生長因子-β1的作用尤為突出。 根據(jù)我們早期的研究成果及已有的報(bào)道,我們推測UC患者的腸上皮細(xì)胞中MFG-E8含量下降可能參與了該病的發(fā)病機(jī)制,患者腸上皮細(xì)胞高凋亡率、高炎性反應(yīng)性以及損傷修復(fù)減慢可能與其中MFG-E8含量不足有關(guān)。 目的 1.體外培養(yǎng)人結(jié)直腸癌來源的腸上皮細(xì)胞株HT-29和Caco-2,應(yīng)用慢病毒包裝的MFG-E8短發(fā)夾RNA (ShRNA)載體進(jìn)行RNA干預(yù),獲得MFG-E8沉默的腸上皮細(xì)胞克隆。 2.檢測MFG-E8基因沉默的腸上皮細(xì)胞中凋亡以及凋亡相關(guān)分子的改變。同時(shí)應(yīng)用重組人MFG-E8蛋白作用于腸上皮細(xì)胞,檢測凋亡相關(guān)分子的改變。 3.檢測MFG-E8基因沉默的腸上皮細(xì)胞對TNF-alpha及Flagellin刺激的炎性反應(yīng)性變化,并給予腸上皮細(xì)胞重組人MFG-E8提前處理,觀察處理后的炎性反應(yīng)性變化。 4.檢測MFG-E8基因沉默的腸上皮細(xì)胞損傷后修復(fù)能力、重組人MFG-E8對腸上皮細(xì)胞損傷后修復(fù)的影響以及相關(guān)促修復(fù)因子的變化。 方法 1.細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)直腸癌來源的腸上皮細(xì)胞株HT-29及Caco-2培養(yǎng)于添加了10%胎牛血清(V/V)的高糖型DMEM中,培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2和95%濕度。 2.慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)以及MFG-E8沉默的腸上皮細(xì)胞克隆的獲得 應(yīng)用慢病毒包裝的MFG-E8靶向的ShRNA載體來進(jìn)行MFG-E8沉默,載體同時(shí)攜帶有嘌呤霉素抗性基因。應(yīng)用coGFP對照病毒來摸索MOI值。兩種細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的慢病毒MOI值均為100。細(xì)胞融合率達(dá)30%-50%時(shí)加入聚凝胺及病毒液的混合物,12小時(shí)后換液。72小時(shí)后熒光顯微鏡下觀察根據(jù)熒光情況來監(jiān)測轉(zhuǎn)導(dǎo)效率并篩選出每種細(xì)胞合適的MOI值。加入100ug/ml嘌呤霉素加壓培養(yǎng),每2-3天更換含有新鮮嘌呤霉素的培養(yǎng)基。加壓培養(yǎng)約3周后可見明顯的細(xì)胞克隆形成。挑選出單個(gè)克隆,消化傳代后繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增,從而篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞克隆。 3.細(xì)胞RNA提取及實(shí)習(xí)熒光定量PCR 細(xì)胞RNA提取應(yīng)用Trizol,反轉(zhuǎn)錄應(yīng)用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶,實(shí)時(shí)熒光定量PCR中應(yīng)用SYBR Green試劑,反應(yīng)在羅氏Lightcycler2.0儀器上進(jìn)行。人beta-actin基因?yàn)閮?nèi)參,結(jié)果采用2-△△CT分析方法。 4.細(xì)胞總蛋白提取及western blotting 使用RIPA裂解液,裂解產(chǎn)物經(jīng)14000rpm4℃離心10分鐘,吸取上清液,即為總蛋白。蛋白濃度測定應(yīng)用BCA法。蛋白中加入上樣緩沖液后煮沸變性,經(jīng)不同濃度的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后,電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2小時(shí)后,將膜依次孵育一抗二抗。次日用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白條帶。 5.細(xì)胞凋亡檢測 細(xì)胞凋亡檢測應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)以及Annexin Ⅴ-FITC凋亡檢測試劑盒。細(xì)胞融合率達(dá)60-70%時(shí),將漂浮細(xì)胞及貼壁細(xì)胞均收集起來,PBS洗滌2次后,重懸于binding buffer中。隨后加入AnnexinⅤ-FITC及碘化丙啶,室溫避光孵育10分鐘后,在BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀上檢測Annexin V-FITC結(jié)合情況。凋亡形態(tài)學(xué)檢測應(yīng)用Hoechst33342染色,隨后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)。 6.細(xì)胞傷痕愈合試驗(yàn) 細(xì)胞選取合適的密度種板,以次日能長滿為宜。采用經(jīng)典的細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn),用無菌槍頭在長滿細(xì)胞的平板上劃三條直線,PBS沖洗3次沖掉漂浮的細(xì)胞,加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。劃痕后0小時(shí)及24小時(shí)后于倒置顯微鏡下觀察拍照,并測量劃痕處的寬度,計(jì)算出24小時(shí)內(nèi)細(xì)胞的遷移距離。 結(jié)果 1.腸上皮細(xì)胞中MFG-E8的表達(dá)以及MFG-E8沉默的驗(yàn)證 普通PCR及western blotting證實(shí)了MFG-E8mRNA及蛋白在HT-29及Caco-2兩種腸上皮細(xì)胞株中均有表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR證實(shí)了與轉(zhuǎn)導(dǎo)LV-C的細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)導(dǎo)了LV-M的HT-29及Caco-2細(xì)胞中,MFG-E8mRNA表達(dá)量明顯抑制。Western blotting結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了轉(zhuǎn)導(dǎo)LV-M后兩種細(xì)胞中MFG-E8蛋白水平明顯受到抑制。 2.凋亡及凋亡相關(guān)分子的檢測 Annexin V-FITC染色后的流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)了MFG-E8沉默導(dǎo)致了腸上皮細(xì)胞中凋亡率增加。Hoechst33342染色結(jié)果證實(shí)了MFG-E8沉默后的IEC中核固縮、核碎裂等的凋亡細(xì)胞比率明顯增加。同時(shí)實(shí)習(xí)熒光定量PCR及western blotting發(fā)現(xiàn)MFG-E8沉默后的腸上皮細(xì)胞中存在促凋亡因子BAX及活化型Caspase-3表達(dá)水平的明顯上調(diào),而內(nèi)源性抑制凋亡因子BCL-2含量明顯下調(diào)。為進(jìn)一步證實(shí)MFG-E8的抗凋亡作用,我們將HT-29及Caco-2細(xì)胞與重組人MFG-E8孵育,發(fā)現(xiàn)MFG-E8在100ng/ml時(shí)即可顯著上調(diào)凋亡抑制因子BCL-2的表達(dá),同時(shí)伴有促凋亡因子BAX以及活化型caspase-3的下降。 3.腸上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)性檢測 應(yīng)用腫瘤壞死因子(TNF)-alpha及鞭毛蛋白(Flagellin)刺激能顯著誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞IL-8mRNA的產(chǎn)生。MFG-E8沉默后,IEC中基礎(chǔ)IL-8mRNA表達(dá)量及TNF-alpha、Flagellin誘導(dǎo)的IL-8mRNA表達(dá)量并無明顯差異。預(yù)先給予HT-29及Caco-2細(xì)胞重組人MFG-E8處理后再給予TNF-α及flagellin刺激,所誘導(dǎo)的IL-8mRNA表達(dá)量與未予重組人MFG-E8處理組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 4.細(xì)胞傷痕愈合實(shí)驗(yàn)及腸粘膜促修復(fù)因子的檢測 細(xì)胞劃痕24小時(shí)后,MFG-E8沉默的HT-29細(xì)胞的遷移距離明顯小于轉(zhuǎn)導(dǎo)對照病毒的HT-29細(xì)胞。同時(shí),MFG-E8沉默可抑制IEC中腸粘膜促修復(fù)因子腸三葉肽3(TFF3)mRNA的表達(dá),但是對另一修復(fù)相關(guān)的重要因子轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1mRNA水平并無影響。 結(jié)論 1.MFG-E8在IEC中起了抑制凋亡的作用,IEC中MFG-E8的沉默伴隨著凋亡相關(guān)分子BCL-2和BAX的改變。 2.MFG-E8能促進(jìn)IEC損傷后的修復(fù),IEC中MFG-E8的沉默伴隨著腸粘膜修復(fù)因子TFF3的表達(dá)的下降。 3.MFG-E8不影響IEC中基礎(chǔ)IL-8mRNA表達(dá)水平以及TNF-alpha和Flagellin刺激所誘導(dǎo)的IL-8mRNA表達(dá)水平。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2012
【中圖分類】：R574.62
【文章目錄】：
符號說明
第一部分 MFG-E8在潰瘍性結(jié)腸炎患者腸粘膜中的表達(dá)及其與粘膜炎癥分級和疾病活動(dòng)指數(shù)的相關(guān)性分析
    中文摘要
    ABSTRACT
    前言
    研究對象與方法
    結(jié)果
    討論
    結(jié)論
    附圖表
    參考文獻(xiàn)
第二部分 MFG-E8在人腸上皮細(xì)胞中功能的體外研究
    中文摘要
    ABSTRACT
    前言
    材料和方法
    結(jié)果
    討論
    結(jié)論
    附圖
    參考文獻(xiàn)
致謝
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參與科研基金項(xiàng)目
科研獎(jiǎng)勵(lì)
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英文論文二

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2835620