第一節(jié)HBX在體外對肝臟卵圓細胞增殖的直接促進作用 目的:研究乙型肝炎病毒編碼X蛋白在體外對肝臟卵圓細胞增殖的促進作用. 方法:運用熒光顯微鏡觀察及Western blot對穩(wěn)定表達HBX的大鼠肝臟卵圓細胞系HBX-EGFP-LE/6進行鑒定。以轉(zhuǎn)染HBX細胞系HBX-EGFP-LE/6為實驗組,轉(zhuǎn)染標記綠色熒光蛋白空載體EGFP-LE/6、LE/6細胞系為對照組,通過MTT細胞增殖活力實驗及EDU摻入實驗比較三組細胞DNA合成速度。 結(jié)果:HBX在部分細胞克隆穩(wěn)定高表達,對照組細胞未檢測到HBX表達。HBX對肝臟卵圓細胞的增殖具有促進作用,在同步化后培養(yǎng)24h、48h、72h,與對照組相比,HBX-EGFP-LE/6卵圓細胞系增殖加快,差異有統(tǒng)計學意義(p0.01)。在血清刺激后,與對照組相比,HBX-EGFP-LE/6卵圓細胞系DNA合成加快,差異有統(tǒng)計學意義(p0.01)。 結(jié)論:細胞內(nèi)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并表達的HBX蛋白對體外培養(yǎng)的肝臟卵圓細胞的增殖具有直接促進作用,并且促進其S期DNA合成。 第二節(jié)HBX對卵圓細胞周期蛋白表達的調(diào)控作用 目的:研究HBX對肝臟卵圓細胞中細胞周期調(diào)控蛋白表達水平的影響,探討HBX促進肝臟卵圓細胞增殖的分子基礎(chǔ)。 方法:穩(wěn)定表達HBX基因的肝臟卵圓細胞克隆為實驗組,表達綠色熒光蛋白的空載體組和LE/6卵圓細胞為對照組。Western blot檢測細胞周期調(diào)控蛋白cyclinD1、CDK2、CDK4、p21、p27的表達水平 結(jié)果:與對照組相比,cyclinD1的蛋白表達水平在HBX-EGFP-LE/6細胞中顯著上調(diào),p27蛋白的表達輕微下調(diào)。 結(jié)論:HBX在肝臟卵圓細胞中影響細胞周期相關(guān)基因的蛋白表達水平,可能是其促進肝臟卵圓細胞增殖的分子基礎(chǔ)之一。 第三節(jié)HBX對肝卵圓細胞MAPK信號及AKT信號的影響 目的:研究HBX在卵圓細胞LE/6中對MAPK通路信號的影響,探討HBX促進LE/6卵圓細胞增殖的分子機制。 方法:穩(wěn)定表達HBX基因的HBX-EGFP-LE/6肝臟卵圓細胞為實驗組,表達綠色熒光蛋白的空載體組和LE/6卵圓細胞為對照組;Western blot檢測了ERK、AKT、JNK、p38、p-ERK、pAKT、p-JNK、p-p38在對照組與實驗組卵圓細胞內(nèi)的表達水平。 結(jié)果:與對照組比較,在HBX-EGFP-LE/6中,p-ERk、p-Akt的表達水平升高。但ERK、Akt、JNK、p38、p-p38、p-JNK在三種細胞中的蛋白表達水平?jīng)]有明顯變化。 結(jié)論:胞內(nèi)穩(wěn)定表達的HBX蛋白可以在體外培養(yǎng)的肝臟卵圓細胞中上調(diào)ERK、AKT信號。 第四節(jié)HBX上調(diào)cyclinD1表達并促進肝臟卵圓細胞增殖依賴于HBX上調(diào)的ERK及AKT信號 目的:研究HBX促進卵圓細胞增殖及上調(diào)cyclinD1是否依賴于HBX-EGFP-LE/6內(nèi)上調(diào)的ERK和/或AKT信號 方法:穩(wěn)定表達HBX基因的HBX-EGFP-LE/6肝臟卵圓細胞為實驗組,表達綠色熒光蛋白的空載體組和LE/6卵圓細胞為對照組;運用特異性信號通路抑制劑LY294002,PD184352阻斷卵圓細胞MEK/ERK及PI-3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo),然后在指定時間點western blot檢測cyclinD1在各組細胞中的表達情況; MTT檢測阻斷干預(yù)72h后各組細胞的增殖活性。 結(jié)果:抑制劑PD184352阻斷通路72h后,干預(yù)組HBX-EGFP-LE/6細胞較未干預(yù)組細胞增殖活性降低,差異有統(tǒng)計學意義(p0.01)。抑制劑PD184352阻斷通路72h后,干預(yù)組HBX-EGFP-LE/6細胞較未干預(yù)組細胞增殖活性降低,差異有統(tǒng)計學意義(p0.01)。HBX-EGFP-LE/6細胞中的CyclinD1蛋白高表達水平在兩種抑制劑分別作用后均不能維持。 結(jié)論: HBX上調(diào)的卵圓細胞增殖活性和CyclinD1表達水平,依賴于HBX上調(diào)的ERK及AKT信號。 第一節(jié)HBX降低肝臟卵圓細胞對TGFβ1增殖抑制效應(yīng)敏感性 目的:研究卵圓細胞中HBX蛋白對TGFβ1增殖抑制效應(yīng)的影響。方法: HBX-EGFP-LE/6卵圓細胞作為實驗組, LE/6和EGFP-LE/6卵圓細胞作為對照組。運用Real-time和estern blot檢測三組卵圓細胞中TGFβ受體2 mRNA及蛋白表達水平。MTT試驗比較外源性TGFβ1在三組卵圓細胞中的增殖抑制效應(yīng)。結(jié)果: TGFβ受體2在HBX- EGFP-LE/6中的m RNA及蛋白表達水平均下調(diào)。MTT表明外源性TGFβ1在對照組細胞中具有更強的增殖抑制效應(yīng),差異有統(tǒng)計學意義(p0.01)。結(jié)論:HBX影響卵圓細胞對TGFβ1增殖抑制效應(yīng)的敏感度,可能與TGFβ受體2的基因表達水平下調(diào)有關(guān)。 目的:研究乙型肝炎病毒編碼X蛋白HBX對肝臟卵圓細胞中TGFβ/smad中核心元件samd2、samd3、samd4表達的調(diào)控作用。 方法:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBX基因的大鼠卵圓細胞株HBX-EGFP-LE/6作為實驗組,轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白標記空載體的大鼠卵圓細胞株EGFP-LE/6,大鼠卵圓細胞株LE/6作為對照組檢測TGFβ/smad信號通路中的核心元件smad2、smad3、samd4的表達情況。Real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染細胞系HBX-EGFP-LE/6,以及對照組EGFP-LE/6,LE/6中smad2、smad3、smad4的mRNA表達水平,western blot檢測三組細胞中smad2、smad3、smad4蛋白表達情況。 結(jié)果:與對照組相比,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBX基因的大鼠卵圓細胞株HBX-EGFP-LE/6中smad2的mRNA及蛋白表達水平未有顯著變化。smad3、smad4的mRNA表達水平有顯著降低(p0.05),Smad3蛋白表達水平有一定程度降低,smad4蛋白表達水平?jīng)]有顯著變化。 結(jié)論:乙型肝炎病毒編碼X蛋白可以在卵圓細胞中影響TGFβ/smad信號通路中的核心元件smad3的轉(zhuǎn)錄及蛋白合成,對samd4的轉(zhuǎn)錄有一定影響,對smad2的表達沒有顯著作用。
【學位單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2011
【中圖分類】：R512.62
【部分圖文】：

細胞為陽性對照。其中 4、17、19 號克隆高表達 HBX 基因E/6 細胞中無 HBX 表達。觀察 HBX-EGFP-LE/6、EGFP-LE/6 細胞中綠色熒光蛋白表達/6、EGFP-LE/6 不同細胞克隆中均可見強度不等的綠色熒光。1 、E2 各組細胞綠色熒光陽性率＞95％。

圖 1 HBX-L02 細胞為陽性對照。其中 4、17、19 號克隆高表達 HBX 基因。對照EGFP-LE/6、LE/6 細胞中無 HBX 表達。2、熒光顯微鏡觀察 HBX-EGFP-LE/6、EGFP-LE/6 細胞中綠色熒光蛋白表達情況。HBX-EGFP-LE/6、EGFP-LE/6 不同細胞克隆中均可見強度不等的綠色熒光。其中 XX17、X19、E1 、E2 各組細胞綠色熒光陽性率＞95％。

表一 MTT 檢測六組卵圓細胞增殖活性（mean±SD,n=6）h LE/6 E1 E2 X4 X17 X1912 0.25±0.03 0.23±0.03 0.25±0.02 0.25±0.02 0.24±0.02 0.23±0.0224 0.25±0.04 0.25±0.03 0.24±0.03 0.29±0.03 0.29±0.03 0.29±0.0348 0.44±0.04 0.43±0.05 0.44±0.09 0.58±0.06 0.56±0.07 0.58±0.0672 0.64±0.07 0.63±0.08 0.63±0.05 1.02±0.09 1.00±0.11 0.99±0.19

【共引文獻】

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4 王小平 ,陳瑞芬 ,宋愛利 ,劉國貞;人胎肝干細胞的體外誘導(dǎo)分化[J];陜西醫(yī)學雜志;2003年03期

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本文編號：2833240