肝纖維化是慢性肝病發(fā)展為肝硬化乃至肝功能衰竭的病理基礎(chǔ),因而,阻止肝纖維化發(fā)生這一過程已經(jīng)成為國內(nèi)外研究慢性肝病的中心議題。在這一過程中細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)的生成和降解失衡,其量和質(zhì)發(fā)生變化,從以Ⅳ型膠原組成為主,變?yōu)橐岳w維膠原組成為主(如Ⅰ型、Ⅲ型膠原)。由此肝臟的質(zhì)地、韌度及血流動力學(xué)發(fā)生改變,使肝功能出現(xiàn)異常,并且可能引起多種并發(fā)癥。 肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cells,HSCs)在月纖維化過程中被激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞,生成細(xì)胞外基質(zhì)及一系列生長因子、促炎因子,這奠定了HSCs在肝纖維化過程中的中心地位。因此,干預(yù)HSCs、影響其生物學(xué)行為是阻斷、減輕甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化的研究切入點。 Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein, RKIP)是1999年被Yeung K等利用酵母雙雜交篩選法分離出的一種Raf激酶抑制蛋白,它可以與Raf-1結(jié)合抑制其磷酸化MEK,從而抑制Raf-1/MEK/ERK1,2信號通路的激活,進(jìn)而可以影響HSCs的增殖分化等生物學(xué)行為。近年來RKIP在癌癥中的功能和作用研究較多,同時國內(nèi)有研究證實RKIP可以抑制HSCs細(xì)胞的增殖,促進(jìn)HSCs的細(xì)胞遷移。本研究我們將揭示RKIP在HSCs粘附過程中的作用。 目的：本文主要通過RKIP過表達(dá)及RNAi技術(shù),模擬不同生理病理狀態(tài)下ECM成分的改變,探討RKIP對HSCs粘附功能的影響。 方法：實驗LX-2細(xì)胞共分四組,分別是RKIP過表達(dá)組(RKIP-Ad)及陰性對照組(GFP-Ad);應(yīng)用用RNAi技術(shù)的RKIP抑制組(RKIP-RNAi-Ad)及陰性對照組(NC-GFP-Ad)。首先確定細(xì)胞感染病毒的最適MOI(multiplicity of infection)值：體外培養(yǎng)傳代LX-2細(xì)胞株,72h傳代一次。當(dāng)細(xì)胞融合至80%左右時開始給予感染病毒,MOI值設(shè)四個水平,分別是5、10、15、20。于12h、24h、48h時在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài),計數(shù)細(xì)胞熒光數(shù),通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行感染率的驗證,篩選出最適MOI值及感染時間。其次確定感染病毒后是否確有RKIP的過表達(dá)和抑制：以最適MOI值及感染時間感染細(xì)胞,Western Blot方法驗證各組RKIP表達(dá)情況。應(yīng)用透射電鏡觀察細(xì)胞間連接。已干預(yù)好的細(xì)胞稀釋成1.0×105/ml的濃度種在蓋玻片和已準(zhǔn)備好的由Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原、1matrigel及fibronectin包被的24孔板中,每種干預(yù)設(shè)3個復(fù)孔,1h后200×下取12個視野計數(shù)粘附的細(xì)胞數(shù),資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,進(jìn)行統(tǒng)計分析。 結(jié)果： 1人HSCsLX-2細(xì)胞株的腺病毒感染率可達(dá)到80%～90%。適宜的MOI值為5,感染時間為48h。感染時間過短,熒光表達(dá)率低;MOI值過大則細(xì)胞毒性過大,細(xì)胞狀態(tài)變差,甚至碎裂。 2RKIP過表達(dá)組較對照組蛋白表達(dá)增多(3.47±0.02vs1.74±0.13,P0.05,n=3)。RKIP抑制組較對照組蛋白表達(dá)明顯減少(0.29±0.06vs0.73±0.14,P0.05,n=3)。 3RKIP過表達(dá)促進(jìn)HSCs在glass上的粘附,過表達(dá)組和抑制組的粘附細(xì)胞數(shù)分別為(158±68vs81±12,P0.05,n=12)。RKIP的低表達(dá),抑制其在glass上的粘附(83±10vs131±43,P0.05,n=12)；RKIP在HSCs與基質(zhì)的粘附上的作用與在glass上的作用相反。RKIP的過表達(dá)抑制HSCs與matrigel、I型膠原、Ⅳ型膠原及纖維連接蛋白的粘附。Matrigel上RKIP過表達(dá)組與對照組分別為(80±14vs152±42,P0.05,n=12)；Ⅰ型膠原上為(70±13vs138±36,P0.05,n=12)；Ⅳ型膠原(92±6vs124±32,P0.05,n=12)；纖維連接蛋白(133±27vs276±106,P0.05,n=12)；而RKIP的抑制組促進(jìn)HSCs與以上基質(zhì)的粘附,Matrigel基質(zhì)膠表面的粘附為(170±25vs66±12,P0.05,n=12)；Ⅰ型膠原表面粘附為(200±25vs82±13,P0.05,n=12)；Ⅳ型膠原為(167±22vs96±14,P0.05,n=12)；纖維連接蛋白為(276±28vs96±17,P0.05,n=12)。 結(jié)論：RKIP在肝星狀細(xì)胞粘附的過程中發(fā)揮一定的調(diào)節(jié)作用：RKIP促進(jìn)HSCs在glass上的粘附,抑制其在Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原、matrigel及纖維連接蛋白上的粘附。
【學(xué)位單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2012
【中圖分類】：R575.2
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
前言
材料與方法
結(jié)果
附圖
討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
    REFERENCES
致謝
個人簡歷

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