非酒精性脂肪肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)包括肝臟組織中一系列組織學異常,從單純脂肪變性到脂肪性肝炎,進而可發(fā)展為肝纖維化和肝硬化,這可能導致肝癌的發(fā)生;它還與肥胖,糖尿病及其他代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展緊密相關。目前NAFLD患病人數日益增多,是全球兒童和成人慢性肝病的最常見原因,患病率高達25%左右。在實驗前期階段,基于蛋氨酸膽堿缺乏(Methionine choline deficiency,MCD)飲食誘導的NAFLD模型的小鼠肝臟差異蛋白質組分析,篩選到一個候選蛋白質COTL1,實驗驗證其可能參與NAFLD發(fā)生發(fā)展的進程。COTL1分子是一種F-actin結合蛋白的高度同源蛋白質,目前國內外對COTL1的分子功能研究尚淺,值得注意的是,未見COTL1與NAFLD發(fā)生發(fā)展相關的研究報道。本課題中我們通過構建肝臟細胞特異性COTL1敲除小鼠,建立NAFLD動物模型,探討COTL1在NAFLD發(fā)生發(fā)展中的作用機制。研究目的:(1)證實COTL1對NAFLD發(fā)生發(fā)展的促進作用;(2)確定肝臟哪種細胞中的COTL1具有促進NAFLD發(fā)生發(fā)展的功能;(3)COTL1通過怎樣的機制影響NAFLD的發(fā)生發(fā)展。通過此研究,我們將深化COTL1的分子功能,探討COTL1影響NAFLD發(fā)生發(fā)展的作用機制,并可能為NAFLD的防治開辟新的治療靶點和策略。研究方法:(1)MCD飲食誘導NAFLD小鼠模型,利用腺相關病毒(Adeno-associated virus,AAV)載體敲低肝臟COTL1的表達,檢測肝臟特異性敲低COTL1對NAFLD進程的影響。(2)利用Cre-loxP系統(tǒng),構建肝臟枯否細胞(KCs)特異性COTL1敲除小鼠,高脂飲食(HFD)誘導NAFLD小鼠模型,從小鼠表型,血清生化指標,病理切片和脂肪酸代謝等方面進行檢測,探討肝臟KCs特異性敲除COTL1對NAFLD發(fā)生發(fā)展的影響。(3)利用Cre-loxP系統(tǒng),構建肝竇內皮細胞(LSECs)特異性COTL1敲除小鼠,HFD誘導NAFLD小鼠模型,檢測LSECs特異性敲除COTL1對NAFLD發(fā)生發(fā)展的影響。研究結果:(1)正常小鼠MCD飲食成功誘導了NAFLD模型,COTL1在MCD誘導的NAFLD模型小鼠肝臟中的表達量升高。(2)肝臟特異性COTL1敲低小鼠的體重肝重增加,血清轉氨酶升高;肝臟脂肪蓄積減少,脂滴明顯變小減少,脂變程度降低。(3)HFD飲食成功誘導了NAFLD小鼠模型,COTL1在NAFLD模型各階段小鼠肝臟中的表達量升高。(4)HFD誘導的NAFLD模型小鼠肝實質細胞中COTL1的表達水平增加。(5)成功構建了肝臟KCs特異性COTL1敲除小鼠。HFD飲食誘導下,肝臟KCs特異性COTL1敲除小鼠與對照小鼠相比,體重和肝重均明顯減輕,血清轉氨酶和血脂、膽固醇含量下降;顯著增加了脂肪酸氧化分解并減少攝入和合成;細胞炎性因子水平下降;明顯減少了肝臟脂肪堆積,脂滴空泡變小減少;肝臟脂變程度顯著減輕。(6)成功構建了肝臟LSECs特異性COTL1敲除小鼠。HFD飲食誘導下,LSECs特異性COTL1敲除小鼠的體重、肝重下降,血清轉氨酶水平降低,肝損傷減輕;肝臟脂滴蓄積減少;脂肪變性減輕。(7)COTL1的相互作用分子ALOX5的表達量隨著COTL1的表達水平降低而下調。結論:MCD飲食和HFD飲食誘導的NAFLD模型小鼠肝臟中COTL1的表達量均顯著上調。特異性敲低肝臟COTL1的表達能夠改善肝臟脂肪變性,提示COTL1可促進NAFLD的發(fā)生發(fā)展。首次發(fā)現(xiàn)肝臟KCs特異性和LSECs特異性敲除COTL1都能夠明顯減輕肝臟脂肪變性,減緩單純脂肪變性向脂肪性肝炎發(fā)展的進程。COTL1發(fā)揮作用的機制可能與ALOX5有關且COTL1對NAFLD的促進作用是由肝臟實質細胞與非實質細胞協(xié)同調控的。
【學位單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R575.5
【部分圖文】：

圖 1-1：小鼠正常飲食（NC）與 MCD 飲食的體重（A）、肝重（B）及肝重體重比（C）變化圖。n=6 只/組。與 NC 組相比， **P < 0.01 ，***P＜0.001。Fig 1-1: The changes of body weight (A), liver weight (B) and liver weight to body weight ratio (C) between normalchow and MCD diet in mice. n=6. Compared with NC group, ** P < 0.01, *** P < 0.001.3.1.2 小鼠血清生化指標水平變化與正常飲食相比，MCD 飲食 5 周小鼠血清丙氨酸氨基轉移酶(Alanineaminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶（Aspartate aminotransferase，AST）水平顯著升高，肝功能嚴重受損（圖 1-2）。

圖 1-1：小鼠正常飲食（NC）與 MCD 飲食的體重（A）、肝重（B）及肝重體重比（C）變化圖。n=6 只/組。與 NC 組相比， **P < 0.01 ，***P＜0.001。Fig 1-1: The changes of body weight (A), liver weight (B) and liver weight to body weight ratio (C) between normalchow and MCD diet in mice. n=6. Compared with NC group, ** P < 0.01, *** P < 0.001.3.1.2 小鼠血清生化指標水平變化與正常飲食相比，MCD 飲食 5 周小鼠血清丙氨酸氨基轉移酶(Alanineaminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶（Aspartate aminotransferase，AST）水平顯著升高，肝功能嚴重受損（圖 1-2）。

安徽醫(yī)科大學碩士學位論文正常飲食小鼠肝臟顏色紅潤，無異常，MCD 飲食小鼠肝臟體積明顯減小，呈灰黃色，表面可看到明顯的脂肪顆粒。病理檢測結果顯示，正常飲食小鼠肝臟結構完整清晰，無異常病變；MCD 飲食飼養(yǎng) 5 周小鼠肝臟脂肪異常堆積，出現(xiàn)大泡性脂變和炎癥細胞浸潤，偶見氣球樣的肝細胞，脂滴空泡大且密集，肝臟脂變嚴重。（圖 1-3）

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