非酒精性脂肪肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)包括肝臟組織中一系列組織學(xué)異常,從單純脂肪變性到脂肪性肝炎,進(jìn)而可發(fā)展為肝纖維化和肝硬化,這可能導(dǎo)致肝癌的發(fā)生;它還與肥胖,糖尿病及其他代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)。目前NAFLD患病人數(shù)日益增多,是全球兒童和成人慢性肝病的最常見原因,患病率高達(dá)25%左右。在實(shí)驗(yàn)前期階段,基于蛋氨酸膽堿缺乏(Methionine choline deficiency,MCD)飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型的小鼠肝臟差異蛋白質(zhì)組分析,篩選到一個(gè)候選蛋白質(zhì)COTL1,實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其可能參與NAFLD發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程。COTL1分子是一種F-actin結(jié)合蛋白的高度同源蛋白質(zhì),目前國(guó)內(nèi)外對(duì)COTL1的分子功能研究尚淺,值得注意的是,未見COTL1與NAFLD發(fā)生發(fā)展相關(guān)的研究報(bào)道。本課題中我們通過構(gòu)建肝臟細(xì)胞特異性COTL1敲除小鼠,建立NAFLD動(dòng)物模型,探討COTL1在NAFLD發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。研究目的:(1)證實(shí)COTL1對(duì)NAFLD發(fā)生發(fā)展的促進(jìn)作用;(2)確定肝臟哪種細(xì)胞中的COTL1具有促進(jìn)NAFLD發(fā)生發(fā)展的功能;(3)COTL1通過怎樣的機(jī)制影響NAFLD的發(fā)生發(fā)展。通過此研究,我們將深化COTL1的分子功能,探討COTL1影響NAFLD發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制,并可能為NAFLD的防治開辟新的治療靶點(diǎn)和策略。研究方法:(1)MCD飲食誘導(dǎo)NAFLD小鼠模型,利用腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus,AAV)載體敲低肝臟COTL1的表達(dá),檢測(cè)肝臟特異性敲低COTL1對(duì)NAFLD進(jìn)程的影響。(2)利用Cre-loxP系統(tǒng),構(gòu)建肝臟枯否細(xì)胞(KCs)特異性COTL1敲除小鼠,高脂飲食(HFD)誘導(dǎo)NAFLD小鼠模型,從小鼠表型,血清生化指標(biāo),病理切片和脂肪酸代謝等方面進(jìn)行檢測(cè),探討肝臟KCs特異性敲除COTL1對(duì)NAFLD發(fā)生發(fā)展的影響。(3)利用Cre-loxP系統(tǒng),構(gòu)建肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(LSECs)特異性COTL1敲除小鼠,HFD誘導(dǎo)NAFLD小鼠模型,檢測(cè)LSECs特異性敲除COTL1對(duì)NAFLD發(fā)生發(fā)展的影響。研究結(jié)果:(1)正常小鼠MCD飲食成功誘導(dǎo)了NAFLD模型,COTL1在MCD誘導(dǎo)的NAFLD模型小鼠肝臟中的表達(dá)量升高。(2)肝臟特異性COTL1敲低小鼠的體重肝重增加,血清轉(zhuǎn)氨酶升高;肝臟脂肪蓄積減少,脂滴明顯變小減少,脂變程度降低。(3)HFD飲食成功誘導(dǎo)了NAFLD小鼠模型,COTL1在NAFLD模型各階段小鼠肝臟中的表達(dá)量升高。(4)HFD誘導(dǎo)的NAFLD模型小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中COTL1的表達(dá)水平增加。(5)成功構(gòu)建了肝臟KCs特異性COTL1敲除小鼠。HFD飲食誘導(dǎo)下,肝臟KCs特異性COTL1敲除小鼠與對(duì)照小鼠相比,體重和肝重均明顯減輕,血清轉(zhuǎn)氨酶和血脂、膽固醇含量下降;顯著增加了脂肪酸氧化分解并減少攝入和合成;細(xì)胞炎性因子水平下降;明顯減少了肝臟脂肪堆積,脂滴空泡變小減少;肝臟脂變程度顯著減輕。(6)成功構(gòu)建了肝臟LSECs特異性COTL1敲除小鼠。HFD飲食誘導(dǎo)下,LSECs特異性COTL1敲除小鼠的體重、肝重下降,血清轉(zhuǎn)氨酶水平降低,肝損傷減輕;肝臟脂滴蓄積減少;脂肪變性減輕。(7)COTL1的相互作用分子ALOX5的表達(dá)量隨著COTL1的表達(dá)水平降低而下調(diào)。結(jié)論:MCD飲食和HFD飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型小鼠肝臟中COTL1的表達(dá)量均顯著上調(diào)。特異性敲低肝臟COTL1的表達(dá)能夠改善肝臟脂肪變性,提示COTL1可促進(jìn)NAFLD的發(fā)生發(fā)展。首次發(fā)現(xiàn)肝臟KCs特異性和LSECs特異性敲除COTL1都能夠明顯減輕肝臟脂肪變性,減緩單純脂肪變性向脂肪性肝炎發(fā)展的進(jìn)程。COTL1發(fā)揮作用的機(jī)制可能與ALOX5有關(guān)且COTL1對(duì)NAFLD的促進(jìn)作用是由肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞與非實(shí)質(zhì)細(xì)胞協(xié)同調(diào)控的。
【學(xué)位單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R575.5
【部分圖文】：

圖 1-1：小鼠正常飲食（NC）與 MCD 飲食的體重（A）、肝重（B）及肝重體重比（C）變化圖。n=6 只/組。與 NC 組相比， **P < 0.01 ，***P＜0.001。Fig 1-1: The changes of body weight (A), liver weight (B) and liver weight to body weight ratio (C) between normalchow and MCD diet in mice. n=6. Compared with NC group, ** P < 0.01, *** P < 0.001.3.1.2 小鼠血清生化指標(biāo)水平變化與正常飲食相比，MCD 飲食 5 周小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanineaminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate aminotransferase，AST）水平顯著升高，肝功能嚴(yán)重受損（圖 1-2）。

圖 1-1：小鼠正常飲食（NC）與 MCD 飲食的體重（A）、肝重（B）及肝重體重比（C）變化圖。n=6 只/組。與 NC 組相比， **P < 0.01 ，***P＜0.001。Fig 1-1: The changes of body weight (A), liver weight (B) and liver weight to body weight ratio (C) between normalchow and MCD diet in mice. n=6. Compared with NC group, ** P < 0.01, *** P < 0.001.3.1.2 小鼠血清生化指標(biāo)水平變化與正常飲食相比，MCD 飲食 5 周小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanineaminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate aminotransferase，AST）水平顯著升高，肝功能嚴(yán)重受損（圖 1-2）。

安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文正常飲食小鼠肝臟顏色紅潤(rùn)，無異常，MCD 飲食小鼠肝臟體積明顯減小，呈灰黃色，表面可看到明顯的脂肪顆粒。病理檢測(cè)結(jié)果顯示，正常飲食小鼠肝臟結(jié)構(gòu)完整清晰，無異常病變；MCD 飲食飼養(yǎng) 5 周小鼠肝臟脂肪異常堆積，出現(xiàn)大泡性脂變和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，偶見氣球樣的肝細(xì)胞，脂滴空泡大且密集，肝臟脂變嚴(yán)重。（圖 1-3）

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9 王文n

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