背景和目的 克羅恩病(Crohn's disease,CD)是炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)的一個(gè)主要類型,是一種腸道節(jié)段性分布的,慢性透壁性炎性肉芽腫性疾病,可見(jiàn)于全消化道,好發(fā)于小腸,多為小腸結(jié)腸炎。CD在歐美國(guó)家較為常見(jiàn),發(fā)病率約為1～10/10萬(wàn)左右。我國(guó)患病率較低,無(wú)確切統(tǒng)計(jì),但近20年來(lái),隨著國(guó)內(nèi)臨床醫(yī)生對(duì)CD的認(rèn)識(shí)加深,以及雙氣囊小腸內(nèi)鏡的應(yīng)用,CD發(fā)病率在我國(guó)有逐年上升趨勢(shì)。該病病因及發(fā)病機(jī)制至今不明,臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣,易誤診,目前尚無(wú)徹底治愈方法,常用藥物治療效果欠佳,罹患者即使在手術(shù)切除病變腸段后,也可能會(huì)復(fù)發(fā)而成為終身致殘性疾病,嚴(yán)重危害人類健康。 近年來(lái)的觀點(diǎn)認(rèn)為,攜帶遺傳易感基因的宿主在環(huán)境因素參與下,免疫功能紊亂,最終導(dǎo)致疾病發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)NOD2/CARDl5基因序列單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide Polymorphisms,SNP)與CD明顯相關(guān),發(fā)現(xiàn)并證實(shí)其第4、8、11上有3個(gè)SNP(R702W,G908R,3020 insC)與歐美白種人CD顯著相關(guān),并且認(rèn)為NOD2/CARD15基因突變與發(fā)病年齡、病變部位及臨床特征有關(guān)。上述現(xiàn)象在德國(guó)、澳大利亞及英國(guó)等人群中均得到驗(yàn)證,但在日本、我國(guó)香港和浙江地區(qū)的小樣本研究并未發(fā)現(xiàn)上述3個(gè)SNP的改變。由于CD存在著明顯的種族差異性,相對(duì)于西方人群的易感基因不一定適用于我國(guó)人群,而且CD同其它復(fù)雜疾病一樣,單一基因改變并不一定能引起疾病的發(fā)生,基因之間的相互作用以及同環(huán)境之間的相互作用更能解釋疾病的發(fā)病機(jī)理,因此,確定我國(guó)人群CD發(fā)病相關(guān)的易感基因,進(jìn)行連鎖及群體關(guān)聯(lián)分析,對(duì)闡明我國(guó)漢族人群CD的發(fā)生發(fā)展顯得更為緊迫。 目前,國(guó)外多項(xiàng)研究證明CD是一種復(fù)雜的多基因疾病,遺傳因素與環(huán)境因素相互作用導(dǎo)致CD的發(fā)病已逐漸被認(rèn)可,因此,從基因水平上研究CD的發(fā)生發(fā)展及臨床特征,是目前研究的主流,其主要任務(wù)是闡明其發(fā)病的病因及發(fā)病機(jī)制,尋找其相關(guān)的易感基因,對(duì)這一研究的突破不僅能使我們更好地理解CD發(fā)生的病理生理機(jī)制,而且還將能指導(dǎo)我們對(duì)CD進(jìn)行早期診斷、預(yù)防和治療。 NOD2/CARD15基因已被證實(shí)在白色人種CD發(fā)病中起重要作用,與顯著相關(guān)的NOD2/CARD15基因的SNP位點(diǎn)有R702W、G908R、3020insC等。NOD2/CARD15基因是否是中國(guó)CD的易感基因,這些位點(diǎn)與中國(guó)人CD發(fā)病是否相關(guān),以及是否存在其他與中國(guó)人CD發(fā)病相關(guān)的NOD2/CARD15基因突變位點(diǎn)?目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。我們擬對(duì)NOD2/CARD15基因12個(gè)外顯子進(jìn)行DNA測(cè)序,用PCR—RFLP法驗(yàn)證突變位點(diǎn)并探討其在潰瘍性結(jié)腸炎(ulccerativecolitis,UC)及健康人群的分布頻率,發(fā)現(xiàn)與中國(guó)人CD發(fā)病相關(guān)的SNP以及SNP與CD臨床特征的相關(guān)性,為進(jìn)一步研究CD發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ),為防治該病提供理論依據(jù)。同時(shí),為了提高克羅恩病的鏡下診斷,本研究回顧性分析155例經(jīng)雙氣囊內(nèi)鏡檢查的患者,以探討雙氣囊內(nèi)鏡對(duì)小腸疾病的診斷價(jià)值。 方法 回顧性分析155例懷疑小腸病變并經(jīng)雙氣囊內(nèi)鏡檢查的患者的臨床特點(diǎn)。同時(shí)收集南方醫(yī)院消化科及普外科確診臨床資料完整、彼此無(wú)血源關(guān)系的廣東及外省籍CD患者48例(診斷按太原標(biāo)準(zhǔn));潰瘍性結(jié)腸炎(診斷按太原標(biāo)準(zhǔn))患者及門(mén)診健康體檢者(健康對(duì)照,HC)各50例。抽取外周血,提取白細(xì)胞基因組DNA,根據(jù)NOD2/CARD15基因12個(gè)外顯子設(shè)計(jì)15對(duì)引物,PCR擴(kuò)增目的片段。 1.成功擴(kuò)增48例CD患者NOD2/CARD15基因12個(gè)外顯子后,將PCR產(chǎn)物純化,然后通過(guò)ABI377和ABI3730測(cè)序儀采用雙脫氧四色熒光法全自動(dòng)測(cè)讀序列,并與基因庫(kù)數(shù)據(jù)對(duì)照,發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)后,對(duì)該序列進(jìn)行反向測(cè)序,明確該突變位點(diǎn)確實(shí)存在,并用同樣的一對(duì)引物擴(kuò)增50例潰瘍性結(jié)腸炎患者和50例健康者NOD2/CARD15基因相應(yīng)目的片斷,純化PCR產(chǎn)物,用同樣的方法測(cè)序并與基因庫(kù)數(shù)據(jù)對(duì)照。 2.根據(jù)P268S突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)酶切引物及選擇相應(yīng)的內(nèi)切酶,PCR擴(kuò)增目的片段,成功擴(kuò)增后,用BamHI酶切鑒定已發(fā)現(xiàn)的P268S突變位點(diǎn)。并探討其在UC組及健康者組中的發(fā)生頻率。 3.通過(guò)轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增出野生型NOD2蛋白真核表達(dá)載體(pcDNA-wild-NOD2-HA),應(yīng)用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建、克隆出P268S突變型NOD2蛋白真核表達(dá)載體(pcDNA-NOD2-P268S-HA)。 4.成功構(gòu)建出P268S突變型NOD2蛋白真核表達(dá)載體后,把實(shí)驗(yàn)分成空白對(duì)照組、pcDNA3.0空載體組、pcDNA-wild-NOD2-HA組,pcDNA-NOD2-P268S-HA共4組;利用陽(yáng)離子質(zhì)脂體介導(dǎo)體外轉(zhuǎn)染技術(shù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞,再通過(guò)western Blot及RT-PCR法檢測(cè)NOD2蛋白的表達(dá)。 5.各實(shí)驗(yàn)組瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后LPS刺激細(xì)胞30分鐘,然后用western Blot及免疫熒光定位技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的NF-κB核內(nèi)移變化,比較各實(shí)驗(yàn)組中核內(nèi)NF-κB的表達(dá)水平。 結(jié)果 1.155例行雙氣囊小腸內(nèi)鏡檢查的患者中125例發(fā)現(xiàn)病變,陽(yáng)性率為80.6%,檢出的主要疾病有小腸潰瘍(含克羅恩病)、慢性炎癥、Meckel憩室、間質(zhì)瘤、血管畸形、小腸癌等。其中92例懷疑小腸出血者,84例檢出病變,陽(yáng)性率91.3%;39例腹痛患者,檢出病變24例,陽(yáng)性率61.5%;腹瀉、腹脹、消瘦的23例,檢出病變16例,陽(yáng)性率69.6%;1例腹瀉伴頑固性低蛋白血癥者診斷為淋巴管擴(kuò)張癥。病變分布,位于胃及十二指腸9例,小腸病變115例,大腸病變1例,全消化道未發(fā)現(xiàn)病變30例。小腸病變者中潰瘍性病變43例,其主訴為反復(fù)消化道出血者27例,腹痛9例,腹脹4例,消瘦2例,腹瀉1例;病灶數(shù)為單個(gè)的12例,多個(gè)(2個(gè)及以上)31例;病變位于空腸的18例,回腸20例,空腸和回腸都有病變的5例。雙氣囊內(nèi)鏡結(jié)合組織學(xué)檢查對(duì)Meckel憩室、間質(zhì)瘤、癌、血管病變、腸黏連的診斷,與手術(shù)后診斷是完全相符的;而對(duì)潰瘍性病變(主要是克羅恩病)的診斷與手術(shù)后診斷卻相差較大,符合率為4/7(57.1%)。檢查中發(fā)生小腸穿孔和急性腸梗阻并發(fā)癥各1例,均經(jīng)及時(shí)處理而痊愈。 2.通過(guò)DNA測(cè)序及PCR-RFLP酶切驗(yàn)證,有5例CD患者發(fā)現(xiàn)有P268S突變,其中3例為雜合子改變,2例為純合子改變,發(fā)生率為10.4%,其堿基有C變成T,密碼子有CCC變成UCC,編碼的氨基酸有脯氨酸變?yōu)榻z氨酸,而UC組和HC組沒(méi)有發(fā)現(xiàn)1例P268S突變,各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fisher精確概率檢驗(yàn)P=0.003),在對(duì)NOD2/CARD15基因12個(gè)外顯子其他片段的測(cè)序中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)新的突變位點(diǎn)。提示P268S可能是NOD2/CARD15基因與中國(guó)人相關(guān)的突變位點(diǎn)。所有病例沒(méi)有發(fā)現(xiàn)1例有R702W,G908R及3020 insC三個(gè)常見(jiàn)于西方人的基因多態(tài)位點(diǎn)。 3.48例CD患者中,12例發(fā)病年齡小于20歲的患者中有4例發(fā)現(xiàn)P268S突變,36例發(fā)病年齡大于20歲的患者中只有1例發(fā)現(xiàn)P268S突變,按Fisher精確概率檢驗(yàn)(下同),兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011),說(shuō)明P268S突變與CD患者的發(fā)病年齡明顯相關(guān)。36例男性患者中發(fā)現(xiàn)3例P268S突變,12例女性患者中發(fā)現(xiàn)2例P268S突變,兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.587),說(shuō)明P268S與CD患者的性別無(wú)相關(guān)性。5例有P268S突變者病變部位均在回腸,而病變位于結(jié)腸及其他者未見(jiàn)1例P268S突變,,各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001),說(shuō)明P268S突變與CD患者的發(fā)病部位有明顯相關(guān)性,有P268S突變的CD患者病變部位主要在回腸。5例有P268S突變的患者全部并發(fā)有腸腔狹窄,而32例無(wú)并發(fā)腸腔狹窄的患者中無(wú)1例有P268S突變,兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003),說(shuō)明P268S突變與CD患者的并發(fā)癥有明顯相關(guān)性,有P268S突變的CD患者較易并發(fā)腸腔狹窄、腸梗阻。26例中度病變的患者中發(fā)現(xiàn)4例P268S突變,11例重度病變的患者中發(fā)現(xiàn)1例P268S突變,兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.289),說(shuō)明P268S突變與CD患者的病變程度無(wú)明顯相關(guān)性。 4.經(jīng)克隆、酶切鑒定及基因測(cè)序證實(shí)成功獲得P268S突變型NOD2蛋白真核表達(dá)載體。各表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)入人胚腎細(xì)胞48小時(shí)后,western Blot及RT-PCR分別驗(yàn)證NOD2蛋白得到有效表達(dá)。P268S突變型與野生型NOD2蛋白的表達(dá)均能增強(qiáng)LPS刺激后HEK293T細(xì)胞中NF-κB的核內(nèi)移水平,但兩者之間的差別不明顯。 結(jié)論 1.對(duì)克羅恩病而言,雙氣囊內(nèi)鏡是安全、有效的診斷方法,特別在發(fā)現(xiàn)小腸的病灶方面,但僅靠潰瘍的形狀、數(shù)目(即使結(jié)合內(nèi)鏡組織活檢),對(duì)克羅恩病的診斷也未必是特異的,及時(shí)行外科處理對(duì)某些潰瘍性病變的診斷和治療都是有益的。 2.P268S可能是NOD2/CARD15基因與中國(guó)人CD發(fā)病明顯相關(guān)的SNP,而與UC無(wú)關(guān)。 3.除P268S外沒(méi)有發(fā)現(xiàn)新的突變位點(diǎn)。 4.我們的研究未發(fā)現(xiàn)R702W,G908R及3020 insC三個(gè)常見(jiàn)于西方人CD的基因多態(tài)位點(diǎn)。 5.P268S與CD的發(fā)病年齡、病變部位及并發(fā)癥有關(guān),而與患者的性別及病變嚴(yán)重程度無(wú)關(guān)。有P268S突變的患者發(fā)病年齡多小于20歲、病變部位多在回腸且容易出現(xiàn)腸腔狹窄并發(fā)腸梗阻而需手術(shù)治療。說(shuō)明NOD2/CARD15基因可能是部分中國(guó)人CD發(fā)病的易感基因。 6.P268s突變型與野生型NOD2蛋白均能增強(qiáng)LPS刺激后HEK293T細(xì)胞中的NF-κB的活化水平,表明NOD2蛋白的表達(dá)可以促進(jìn)293T細(xì)胞的免疫反應(yīng),增強(qiáng)細(xì)胞抵抗外界刺激能力。 7.P268S突變型與野生型NOD2蛋白對(duì)增強(qiáng)LPS刺激后細(xì)胞中的NF-κB活化水平的差別并不明顯。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2007
【中圖分類】：R574
【部分圖文】：

小腸克羅恩病小腸克羅恩病致腸腔狹窄

其它小腸疾病內(nèi)鏡表現(xiàn)

結(jié)果1、CD患者外周血白細(xì)胞 NODZ/CARD15基因12個(gè)外顯子的PCR擴(kuò)增電泳圖(見(jiàn)圖2一fa~2一10):注:MI為。arkerl，產(chǎn)物大小255bp圖2一la引物l擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1一laeleCtr0PhoresisofNODZ PCRProduet印 叮PlifiedbyPrimerl注:m2為markerll，產(chǎn)物大小635bp圖2一1b引物2擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.l一 lbelee加 PhoresisofNODZ PCRProduct別叮Plified勿Pr誦erZ

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

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本文編號(hào)：2828219