背景與目的 幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,HP)是螺旋狀、微需氧的革蘭氏陰性細(xì)菌,定植在胃上皮細(xì)胞和胃粘膜層。研究表明:約50%的世界人口感染有HP,盡管這些感染者中的大多數(shù)沒有癥狀,但HP的長期感染明顯增加消化性潰瘍和遠(yuǎn)端胃腺癌發(fā)生的危險(xiǎn)。已有越來越多的證據(jù)表明HP是慢性胃炎、消化性潰瘍、胃腺癌和胃粘膜相關(guān)淋巴組織(mucosa-associated lymphoid tissue,MALT)淋巴瘤的重要致病因素。因此,深入探討HP的致病機(jī)制對尋求更新、更好的治療靶點(diǎn)有重要意義。 研究表明HP感染后患者胃粘膜中炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-8、IFN-γ等和非感染患者相比顯著增加,并且認(rèn)為這些炎性細(xì)胞因子的增高和HP激活核因子kappa B(nuclear factor-kappa B,NF-κB)有關(guān)。然而,啟動細(xì)菌與受體相互作用并激活下游信號事件的受體并未完全闡明。 Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是一類進(jìn)化上高度保守的Ⅰ型跨膜蛋白家族,通過識別微生物成分在宿主第一線防御中起重要作用。TLRs識別表達(dá)于病原體上保守的與致病相關(guān)的分子—病原相關(guān)分子模式(pathogen associatedmolecular pattern,PAMP)。TLRs通過識別PAMP激活NF-κB、活化蛋白-1(activatorprotein-1,AP-1)等,啟動一系列的炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng),誘發(fā)炎癥反應(yīng),引起宿主主動和被動免疫,在機(jī)體抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。 研究表明表達(dá)于胃上皮細(xì)胞系的TLR2、TLR5對HP激活NF-κB是必需的,已經(jīng)證實(shí)TLRs基因表達(dá)的差異與感染的臨床結(jié)局有關(guān),以往多以人胃上皮細(xì)胞AGS細(xì)胞系、胃癌MKN45細(xì)胞系及荷蘭豬胃小凹細(xì)胞表達(dá)的TLRs做為研究對象。至今鮮有TLR2、TLR5在人胃粘膜上皮細(xì)胞表達(dá)情況的文獻(xiàn)報(bào)道。故本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerasechain reaction,RT-PCR)方法,半定量檢測12例HP感染患者和12例非HP感染患者的胃粘膜組織中TLR2mRNA及TLR5mRNA的表達(dá),以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作為內(nèi)參照;采用S-P免疫組織化學(xué)染色檢測35例HP感染患者和33例非HP感染患者胃粘膜組織中TLR5蛋白的表達(dá)水平。 本研究的目的是檢測HP感染患者胃粘膜組織中TLR2及TLR5的表達(dá)情況及臨床病理意義,并分析其與HP感染之間的關(guān)系及可能機(jī)制。 材料和方法 HP感染患者胃鏡活檢標(biāo)本(實(shí)驗(yàn)組)35例,非HP感染患者胃鏡活檢標(biāo)本(對照組)33例,取自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)鏡室2008年8月至10月間行電子胃鏡檢查患者活檢標(biāo)本。均經(jīng)~(14)C呼氣試驗(yàn)和快速尿素酶試驗(yàn)證實(shí)。標(biāo)本取出后迅速置于液氮冷凍待用。 按天根生物公司提供的RNAprep pure Tissue Kit試劑盒操作程序分別抽提實(shí)驗(yàn)組、對照組活檢組織總RNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的28S和18S比例,以評估總RNA的完整性;用分光光度計(jì)在260/280nm測定總RNA吸光度,以計(jì)算總RNA的純度;按天根生物公司提供的RealMasterMix(SYBR Green)試劑盒操作程序進(jìn)行SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PER。ABI 7700熒光定量PCR儀自動生成Ct值和熔解曲線,擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)一步用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定�；顧z標(biāo)本采用SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測,由兩位觀察者在雙盲條件下對結(jié)果進(jìn)行評判,用顯微掃描成像系統(tǒng)拍照、儲存圖片。 mRNA相對定量采用比較Ct法(ΔΔCt法);計(jì)數(shù)資料采用x~2檢驗(yàn);計(jì)量資料采用t檢驗(yàn);以a=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn);統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS10.0軟件。 結(jié)果 1.TLR5mRNA在實(shí)驗(yàn)組和對照組均有表達(dá),實(shí)驗(yàn)組TLR5mRNA表達(dá)水平明顯低于對照組,相對表達(dá)量是對照組的0.5倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 2.TLR2mRNA在實(shí)驗(yàn)組和對照組均有表達(dá),兩組間TLR2mRNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 3.實(shí)驗(yàn)組35例患者中有21例TLR5蛋白呈陽性表達(dá),陽性率為60%;對照組中有28例表達(dá)為陽性,陽性率為84.8%,兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 結(jié)論 1.胃粘膜上皮細(xì)胞在mRNA水平表達(dá)有TLR2和TLR5,故表達(dá)于胃上皮細(xì)胞的TLRs可能和HP相互作用,引起胃粘膜的炎癥,造成靶器官的損害。 2.在mRNA和蛋白水平,HP感染可下調(diào)胃粘膜上皮細(xì)胞TLR5的表達(dá),可能是HP感染長期存在的原因之一。 3.TLR2可能在機(jī)體對HP感染的免疫反應(yīng)中不起主要作用。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R573
【部分圖文】：

TLRS在胃粘膜組織中的表達(dá):陽性細(xì)胞定位于胞膜和/或胞質(zhì)中，呈棕黃褐色(圖A:SP

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2825074