背景： 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致病毒相關(guān)性慢性肝臟疾病最常見的原因之一。據(jù)估計全世界約有3億慢性HBV攜帶者,我國的HBV感染者約為1.2億。慢性HBV感染可引起包括無癥狀攜帶、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)、肝硬化和肝癌,或進(jìn)展為肝衰竭(liver failure, LF)的一系列肝臟疾病譜。慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure, ACLF)是在慢性乙肝病毒感染基礎(chǔ)上,由于病毒復(fù)制、感染、內(nèi)毒素血癥及勞累飲酒等誘因,引起的肝臟急性炎癥加重,肝臟發(fā)生大塊或亞大塊壞死,導(dǎo)致病情急劇加重,引起肝衰竭。中國80%的ACLF患者與HBV感染相關(guān)。ACLF的死亡率很高,在未進(jìn)行肝移植的患者中高達(dá)(60-80)%。 在CHB基礎(chǔ)上進(jìn)展為肝衰竭的機(jī)制復(fù)雜,HBV病毒和機(jī)體免疫的因素都起著重要的作用。既往文獻(xiàn)報道HBV病毒變異,特別是前C區(qū)終止密碼子(G1896A,PC)和基本核心啟動子(basie core promoter, A1762T/G1764A, BCP)的變異率在急性肝衰竭的患者中明顯升高；PC和BCP變異下調(diào)了作為免疫耐受原的HBeAg,血清中HBeAg下降或缺如,導(dǎo)致HBcAg表達(dá)增加,使Th1輔助細(xì)胞發(fā)動細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytoxic T lymphocyte, CTL)攻擊感染的肝細(xì)胞,從而導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死。 HBcAg作為CTL靶抗原,包含有多個能被CTL識別的表位(epitope)。表位是特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答得以激發(fā)的主要原動力,處于免疫識別和免疫激活的核心位置。核苷酸的轉(zhuǎn)換、插入和缺失可導(dǎo)致氨基酸的有義突變,當(dāng)這種突變影響到病毒的特異性T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞表位的序列和序列構(gòu)象時,進(jìn)一步會影響與HLA分子的結(jié)合力或與B、T淋巴細(xì)胞受體的結(jié)合力,從而影響宿主針對病毒的免疫應(yīng)答能力。在一些腫瘤和其他病毒細(xì)胞免疫應(yīng)答方面,研究已證實基因變異會導(dǎo)致T細(xì)胞表位漂移(epitope drift),從而改變了表位的免疫原性,進(jìn)而影響疾病的發(fā)展與預(yù)后。 目的： 以中國廣東地區(qū)ACLF患者為主要對象,從HBV變異影響基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控和影響宿主免疫應(yīng)答兩個方面,探討病毒變異與ACLF患者發(fā)病的關(guān)系。 方法： 39例ACLF患者和38例嚴(yán)重肝炎活動患者(severe hepatitis B, SHB)作為主要研究對象。其中ACLF診斷標(biāo)準(zhǔn)：在慢性肝病的基礎(chǔ)上急性起病,15天至26周出現(xiàn)以下臨床表現(xiàn)者：①極度乏力,有明顯的消化道癥狀；②黃疸迅速加深,血清總膽紅素(TB)≥正常值上限10倍,或每日上升≥17.1μmol／1；③凝血酶原時間明顯延長,凝血酶原活動度(PTA)≤40%。SHB定義參照文獻(xiàn)的報道：丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)≥600U／l、TB≥51.3μmol／l和PTA≤50%。作為對照組的44例CHB患者定義為：HBV表面抗原(HBsAg)陽性半年以上,出現(xiàn)的輕度或中度肝炎活動,即ALT波動于(80-400)U／l和TB≤17.1μmol／l。以上患者臨床和實驗室檢查均無明顯肝硬化征象。ACLF和SHB的患者平均隨訪10.6月(最長17個月,最短3個月)。采集患者的臨床資料和血清標(biāo)本。抽提DNA,通過聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)擴(kuò)增和測序HBV前C／C區(qū),通過克隆測序的方法對HBV混合株感染加以驗證。通過生物預(yù)測網(wǎng)站SYFPEITHI和BIMAS分析線性Th細(xì)胞表位和CTL表位發(fā)生變異后與HLA分子的結(jié)合能力,用HBcAg X線衍射3D結(jié)構(gòu)分析B細(xì)胞表位變異后構(gòu)型的改變。用五聚體染色(pentamer staining)技術(shù)探討表位免疫原性的改變。 結(jié)果： 1)臨床資料的比較：ACLF組與SHB組比較TB的水平明顯升高,而ALB及PTA均降低；差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；反映腎功能的指標(biāo)血肌酐(Cr)(99.4±94.7vs.75.0±14.1；P0.001)和判斷是否合并感染的指標(biāo)白細(xì)胞總數(shù)(WBC)[8.0±3.2(×109／l)vs.6.2±2.1(×109／l)；P=0.005]在ACLF組也升高。兩組之間HBV基因型分布和BCP、PC變異發(fā)生率均無明顯差異。ACLF中死亡組與存活組相比：PTA明顯降低,WBC明顯升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；Cr也較存活組高,但無顯著性差異(P=0.072)。 2)HBV基因型：ACLF和SHB兩組均以基因B型和C型為主,有1例患者為基因D型；5例患者由于HBV DNA定量低,PCR擴(kuò)增失敗未鑒定基因型,未納入統(tǒng)計。其中基因B型比率分別高達(dá)(26／35,72.2%)和(24／36,68.6%),均高于CHB組(22／44,50%)。SHB組與CHB比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.044)；ACLF組也較CHB組升高,但無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.069)。 3)C基因調(diào)控區(qū)變異 (1) BCP(A1762T/G1764A)的變異率在ACLF中明顯高于CHB組(56.7% vs.32.4%,P=0.046),PC(G1896A)變異率也顯著高于CHB組(50% vs.15.9%,P=0.003)。用“-”表示未變異,用“+”代表變異來進(jìn)行簡化；ACLF組HBV發(fā)生BCP-/PC+和BCP+/PC+的比例明顯高于CHB組,而BCP-／PC-的比例明顯低于CHB組。 (2)在BCP+/PC-、BCP-/PC-、BCP-/PC+和BCP+／PC+模式中HBeAg的陰性率逐步升高,分別為在40%、53%、76.5%和83.3%；而且BCP-／PC+和BCP+/PC+模式下調(diào)HBeAg的作用比其他兩種模式明顯增強(qiáng)；在單變異模式中PC變異下調(diào)HBeAg的作用較BCP變異明顯(P=0.001)。 (3)nt1846 A-T變異的發(fā)生率在ACLF組明顯高于SHB組[80.6%(25／31)vs.16.7%(5／30),P0.001]及CHB組[80.6%(25／31)vs.11.1%(4／36),P0.001]。而該變異位點與本研究中患者的基因型分布無相關(guān)性。 (4) BCP-/PC-模式中HBeAg陰性率在四種模式中并非最低；進(jìn)一步分析在這種模式中ACLF的患者均為HBeAg陰性。而這部分ACLF的患者HBV DNA定量與該模式中SHB的患者無差異。 4) C基因編碼區(qū)變異 (1)C基因編碼區(qū)氨基酸發(fā)生變異的頻率在ACLF組明顯高于CHB組。在ACLF中氨基酸變異率超過10%,且與CHB組比較有統(tǒng)計學(xué)差異的共有7個位點。這些高頻率的變異位點絕大部分位于表位區(qū)域：aa5、aa35和aa60分別位于的Thl-20、Th35-45和Th49-69輔助細(xì)胞表位區(qū),aa27位于CTL18-27細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位區(qū),aa83和aa135分別位于B76-87和B130-135表位區(qū)。進(jìn)一步統(tǒng)計以上表位區(qū)變異的頻率顯示：ACLF在各個表位區(qū)變異頻率均高于CHB組。 (2)aa5和aa60變異存在明顯的相關(guān)性,Pearson相關(guān)系數(shù)為0.632(P0.001)。并且這兩點在隨訪中表現(xiàn)為協(xié)同共變異：即aa5位氨基酸發(fā)生P-T的變異,同時觀察到aa60發(fā)生L-V的變異；或aa5 T-P協(xié)同aa60 V-L。HBcAg晶體3D結(jié)構(gòu)顯示,aa5和aa60在空間構(gòu)型上位置相鄰,分享同一個四螺旋束(four-helix bundle)。網(wǎng)站預(yù)測aa5和aa60所在的肽段作為潛在的CTL表位與HLA分子的結(jié)合力,顯示aa5發(fā)生P-T的變異后引起所在的肽段與HLA-A*0201分子的結(jié)合分?jǐn)?shù)升高了3分(13 vs.16)；而aa60 L-V的變異后所在肽段與HLA-A*0201分子的結(jié)合分?jǐn)?shù)降低。 (3)對于高變異位點所位于的已知線性Th細(xì)胞表位和CTL表位通過生物學(xué)網(wǎng)站預(yù)測其免疫原性的改變；對于空間構(gòu)象型B細(xì)胞表位用HBcAg X衍射3D結(jié)構(gòu)分析其構(gòu)型的改變。通過HBcAg晶體結(jié)構(gòu)分析構(gòu)象性B細(xì)胞表位顯示,高變異位點所在的B細(xì)胞表位均位于HBcAg結(jié)構(gòu)中向外側(cè)突出的位置；而在B細(xì)胞表位HBcAg130-135中,aa135處于最向外突出的點。CTL表位HBcAg18-27發(fā)生27位I-V的變異后,SYFPEITHI評分顯示與HLA-A*0201分子的結(jié)合分?jǐn)?shù)升高了2分(24 vs.22)；BIMAS評分顯示HBcAg18-27(V27)與HLA-A*0201結(jié)合的分?jǐn)?shù)為2309.961,而I27為346.494。 5)表位HBcAg18-27 (1)HLA-A*0201限制性特異性CTL表位HBcAg18-27,在中國I27的背景下,ACLF組V27變異率高。在ACLF組V27的發(fā)生率明顯高于CHB組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義[10／39(25.6%)vs.3／44(6.8%)；P=0.019]；同樣,SHB組V27的比率也高于CHB組[8／38(21.1%)vs.3／44(6.8%)；P=0.059]。 (2)為了探討表位HBcAg18-27的動態(tài)變化,隨訪了SHB和ACLF組中10例發(fā)病時V27單一病毒株感染或V27和I27混合株感染的患者,及19例發(fā)病時I27單一病毒株感染的患者。在4例HLA-A2陽性的患者中無論發(fā)病時是V27單一病毒株感染或是V27和I27混合株感染,隨訪后均變異成I27單一病毒株感染；而在5例HLA-A2陰性患者中,隨訪后包含V27的病毒仍能檢測出。進(jìn)一步的克隆測序,驗證了V27向I27轉(zhuǎn)換的變異模式。而18例發(fā)病時感染I27單一病毒株的患者隨訪后仍然為單一I27病毒株感染。 (3)用五聚體技術(shù),分析HBcAg18-27表位變異后免疫原性的差異。分離HLA-A2陽性ACLF和SHB患者的PBMC,用HBcAg18-27兩種形式(I27和V27)的特異性五聚體直接檢測分析特異性CD8細(xì)胞的頻數(shù)；直接檢測的結(jié)果顯示特異性CD8細(xì)胞的頻數(shù)較低,兩組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。對于直接檢測后仍有余留PBMC的患者,將其PBMC增殖培養(yǎng)13天后再進(jìn)行五聚體染色：在案例報道中顯示HBcAg18-27(V27)特異性CD8細(xì)胞的頻數(shù)高于HBcAg18-27(127)特異性CD8細(xì)胞的頻數(shù)。 (4)在ACLF和SHB的患者中,aa27V患者HBV DNA定量低于aa27I的患者,盡管差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.093)。而ACLF組HBV DNA定量明顯低于CHB組[(5.75±1.73 vs.9.16±1.72)log10 copies/ml；P0.001],SHB組也低于CHB組[(5.55±1.61 vs.9.16±1.72)1og10copies/ml；P0.001]. 結(jié)論： 1)與從SHB進(jìn)展為ACLF相關(guān)的因素包括：TB、Cr和WBC的升高,ALB和PTA的降低。在ACLF中,PTA下降及WBC升高與不良結(jié)局相關(guān)。 2)基因B型在ACLF和SHB兩組比率均高于CHB組,且SHB組與CHB組比較有統(tǒng)計學(xué)意義。這表明在中國南方地區(qū)基因B型與嚴(yán)重的肝臟炎癥活動發(fā)病相關(guān)。 3) BCP(A1762T/G1764A)和PC(G1896A)變異率在ACLF組明顯高于CHB組。ACLF組HBV發(fā)生BCP-／PC+和BCP+／PC+的比例明顯高于CHB組,而BCP-／PC-比例明顯低于CHB組。這個結(jié)果證實了A1762T／G1764A和G1896A高變異與ACLF發(fā)病的相關(guān)性。 4)在BCP+/PC-、BCP-/PC-、BCP-/PC+和BCP+/PC+模式中HBeAg的陰性率逐步升高；而且BCP-／PC+和BCP+／PC+模式下調(diào)HBeAg的作用與其他兩種模式相比明顯增強(qiáng)；在單變異模式中PC變異下調(diào)HBeAg作用強(qiáng)于BCP變異；且在ACLF組BCP+／PC+和PC單變異的比例明顯高于CHB組。這表明PC+和BCP+／PC+模式導(dǎo)致的HBeAg與ACLF發(fā)病相關(guān)。 5)C基因編碼區(qū)發(fā)生變異的頻率在ACLF組明顯高于CHB組。ACLF中氨基酸變異率明顯升高的位點絕大部分位于表位區(qū)域。統(tǒng)計各個表位區(qū)變異的頻率,在ACLF組均高于CHB組。這說明表位變異可能在ACLF發(fā)病中起著重要的作用。 6)aa5和aa60變異存在明顯的協(xié)同關(guān)系。兩位點盡管在線性位置相隔遠(yuǎn),但在HBcAg空間構(gòu)型上位置相鄰,分享HBcAg四聚體中同一個螺旋束。通過預(yù)測分析肽段發(fā)生aa5 P-T的變異后與HLA-A*0201結(jié)合力增強(qiáng)；提示aa5變異后可能提高表位的免疫原性、誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)；而aa5 P-T的變異在ACLF中明顯升高(52.63%)；表明aa5T與ACLF的發(fā)病相關(guān)。aa60由于與aa5空間位置相鄰,可能在極性、PH值、親水性等多個因素的影響下,出現(xiàn)協(xié)同變異。 7)HLA-A2限制性CTL表位HBcAg18-27(V27)在ACLF組的比率明顯升高,且隨訪后ACLF患者中,HLA-A2陽性的患者均變異I27；且HBcAg18-27(V27)特異性CD8細(xì)胞的頻數(shù)高于HBcAg18-27(127)特異性CD8細(xì)胞的頻數(shù)。這表明HBcAg18-27(27V)在HLA-A2陽性患者中引起較強(qiáng)的免疫應(yīng)答,在清除了aa27V病毒的同時,導(dǎo)致了肝臟炎癥的發(fā)生,與ACLF的發(fā)病相關(guān)。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2010
【中圖分類】：R575.3
【部分圖文】：

調(diào)節(jié)cp和xp，也調(diào)節(jié)sp。Enhll位于ntl685一773，緊連BCP的上游與CuRS重疊。Ehnll調(diào)節(jié)cP和前sPZ的轉(zhuǎn)錄，優(yōu)先順勢激活sPI。圖1一 1HBv基因組的結(jié)構(gòu)Figl一 1StruetureofHBVgenome在HBV感染和復(fù)制過程中，病毒粒子通過外膜蛋白的前S1區(qū)首先與肝細(xì)胞表面的未知受體接觸，侵入胞漿的病毒脫殼后，核酸DNA進(jìn)入細(xì)胞核，正鏈

第一章研究背景延長成為完整雙鏈，經(jīng)DNA多聚酶補(bǔ)齊缺口成熟為共價閉合環(huán)狀valentclosedcircularDNA，cceDNA)，作為轉(zhuǎn)錄模板合成不同長度的，進(jìn)入胞漿翻譯為病毒的各種蛋白質(zhì)，另有一部分3.skb的m丑NA作為基因組首先與P蛋白結(jié)合，再被二聚體形式的核殼蛋白包裝形成核心顆基因組在核心顆粒內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄為松弛環(huán)狀DNA(relaxedcircularDNA，)，一部分核心顆粒重新進(jìn)入細(xì)胞核補(bǔ)充核內(nèi)cccDNA池，其余核心顆粒s的presl區(qū)結(jié)合，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)獲得包膜，再出芽分泌至細(xì)胞外(圖1一2)。

10個氨基酸;MHC一n類分子限制性表位一般長巧個氨基酸左右。T細(xì)胞表位和HLA分子共同決定了何種T細(xì)胞受體(TCR)被激活，決定了何種T細(xì)胞克隆得以活化和增殖[’8](圖1一3)。HBv發(fā)生核昔酸的轉(zhuǎn)換、插入或缺失，倘若作為有義突變則影響氨基酸的編碼，可能引起表位序列的變異。HBcAg上表達(dá)很多的抗原表位，CTL對HBV表位的應(yīng)答強(qiáng)度對疾病進(jìn)展產(chǎn)生重要影響:倘若反應(yīng)不足，病毒難以清除使感染慢性化;如果反應(yīng)過強(qiáng)，導(dǎo)致肝細(xì)胞廣泛損傷引起病情加重，嚴(yán)重者造成肝衰竭。圖1一 3HBv特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的發(fā)生和效應(yīng)過程Figurel一 CellularimmuneresPonsesofHBV注:圖引至GanemD， NEnglJMed

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

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本文編號：2823521