第一部分內(nèi)毒素刺激對TRAF6基因表達的影響 目的：觀察內(nèi)毒素刺激對小鼠RAW264.7巨噬細胞腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TNF receptor-associated factor-6, TRAF6)基因表達的影響,闡明內(nèi)毒素刺激與TRAF6基因表達的關(guān)系。 方法：RAW264.7細胞分為LPS組、地塞米松組、姜黃素組、實驗對照組和正常對照組。LPS組以終濃度為100μg/L LPS刺激；地塞米松組以終濃度為0.5 mg/L地塞米松預處理8 h,姜黃素組以終濃度為20μmol/L姜黃素預處理8 h；實驗對照組用含DMSO(濃度0.1%)的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),正常對照組作為實驗對照不予以任何處理。LPS刺激2 h、4 h、8 h和16 h后,免疫細胞化學染色檢測TRAF6蛋白表達,realtime-PCR檢測TRAF6 mRNA表達；LPS刺激8 h時Western blot檢測TRAF6蛋白,在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測內(nèi)毒素刺激對TRAF6基因表達的影響。 結(jié)果：小鼠RAW264.7細胞中TRAF6 mRNA的正常表達量相對較低,當LPS刺激4 h時,TRAF6 mRNA表達明顯增加；隨著時間延長其表達進一步增加,至16 h時,TRAF6 mRNA表達達到高峰。用地塞米松和姜黃素干預后,TRAF6 mRNA表達量均低于同一時間LPS組(P0.05),但始終高于正常水平。同一時間點地塞米松組與姜黃素組比較無明顯差異(P0.05),實驗對照組細胞TRAF6 mRNA表達水平較正常對照組無明顯變化(P0.05)。Western blot檢測TRAF6蛋白表達,結(jié)果與TRAF6 mRNA結(jié)果相似。 結(jié)論：TRAF6 mRNA及TRAF6蛋白表達與LPS刺激有明確的時效關(guān)系。 第二部分TRAF6 siRNA表達質(zhì)粒的構(gòu)建和篩選 實驗一TRAF6 siRNA表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 目的：構(gòu)建針對小鼠TRAF6基因的短發(fā)夾RNA (short hairpin RNA, shRNA)真核表達載體,為下一步的細胞轉(zhuǎn)染奠定基礎(chǔ)。 方法：在NCBI的Nucleotide庫中檢索小鼠TRAF6 mRNA序列,應用Invitrogen公司的在線設(shè)計軟件BLOCK-iTTM RNAi Designer,針對小鼠TRAF6 mRNA設(shè)計篩選4條siRNA序列。體外合成編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA寡核苷酸單鏈,經(jīng)退火成互補雙鏈,將相應的雙鏈DNA被插入pGCsi-U6/GFP/Hygro質(zhì)粒中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pGCsi-TRAF6-shRNA1、2、3、4。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進E.coli DH5a,最后以PCR法分析鑒定陽性重組質(zhì)粒并進行DNA測序。在紫外分光光度計上OD260和OD280讀取吸光度值,檢測質(zhì)粒DNA的濃度。 結(jié)果：siRNA寡核苷酸單鏈成功退火,合成雙鏈DNA模板,凝膠電泳可見,59 bpMark處呈現(xiàn)清晰條帶。靶向TRAF6 mRNA的4種重組質(zhì)粒載體pGCsi-TRAF6-shRNA,經(jīng)酶切和DNA測序分析,shRNA編碼序列與設(shè)計的片段完全一致,證實重組質(zhì)粒載體構(gòu)建成功。4種重組質(zhì)粒DNA OD260/OD280比值均在1.8～2.0之間,質(zhì)粒DNA質(zhì)量良好,符合實驗要求,為下一步體外、體內(nèi)實驗奠定了基礎(chǔ)。 結(jié)論：靶向TRAF6基因的重組質(zhì)粒載體pGCsi-TRAF6-shRNA構(gòu)建成功,為研究TRAF6對內(nèi)毒素炎癥反應的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。 實驗二TRAF6基因沉默優(yōu)化序列的篩選和確認 目的：將TRAF6基因特異性重組質(zhì)粒載體pGCsi-TRAF6-shRNA轉(zhuǎn)染RAW 264.7細胞,檢測TRAF6基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達情況,體外篩選干擾小鼠RAW264.7細胞TRAF6基因的最佳重組質(zhì)粒載體pGCsi-TRAF6-shRNA。 方法：使用不同比例的DNA質(zhì)粒／脂質(zhì)體復合物,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至RAW 264.7細胞,熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞48 h后,應用MTT法檢測轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pGCsi-TRAF6-shRNA后細胞活性的變化,realtime-PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染細胞TRAF6基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達,體外篩選出對TRAF6基因表達具有最佳抑制效果的重組質(zhì)粒。 結(jié)果：熒光顯微鏡分析轉(zhuǎn)染效率顯示,DNA(g)/Trans Fectin(L)為2：5時重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率最高。MTT檢測結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒pGCsi-TRAF6-shRNA1、2能顯著抑制RAW264.7細胞的增殖活性,與正常對照組相比有顯著差異(P0.01)。realtime-PCR結(jié)果顯示,pGCsi-TRAF6-shRNA1、2組細胞TRAF6 mRNA表達水平顯著降低。其中,pGCsi-TRAF6-shRNA 1對RAW264.7細胞TRAF6基因表達的抑制作用最為顯著,抑制率為65.25%,與正常對照組相比具有明顯差異(P0.05)。Western blot檢測結(jié)果顯示,pGCsi-TRAF6-shRNA1對靶基因蛋白表達抑制作用最明顯,TRAF6基因蛋白表達抑制率為60.07%,與正常對照組相比差異顯著(P0.05)。 結(jié)論：pGCsi-TRAF6-shRNA1真核表達載體可在體外高效地抑制TTRAF6基因表達,為進一步研究TRAF6基因沉默對內(nèi)毒素炎癥反應的影響奠定基礎(chǔ)。 第三部分TRAF6 siRNA對RAW264.7細胞內(nèi)毒素炎癥的影響 目的體外研究TRAF6沉默基因?qū)AW 264.7細胞內(nèi)毒素炎癥反應的影響。 方法實驗分為5組：(A)pTRAF6-shRNA1(即pGCsi-TRAF6-shRNA1)組,質(zhì)粒pTRAF6-shRNA1+LPS; (B)陽性對照組,姜黃素(20μmol/L)+LPS; (C)陰性對照組,空白質(zhì)粒±LPS；(D)空白對照組,僅予100μg/L LPS刺激；(E)正常對照組,正常培養(yǎng)不予任何處理。LPS刺激后0 h、4 h、8 h和16 h,收集細胞上清,ELISA法測定上清液中TNF-α、IL-1β、TGF-β1。LPS刺激24 h后,收集細胞,realtime PCR方法檢測TRAF6、IL-6、COX-2 mRNA, Western blot檢測細胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達。 結(jié)果100μg/L LPS刺激各組RAW264.7細胞后,細胞上清液中TNF-α、IL-1β、TGF-β1表達量都明顯增加,與正常對照組相比差異顯著(P0.01),其中TNF-α、IL-1β在8 h內(nèi)達高峰,TGF-β1在16 h達高峰,說明LPS刺激可引起細胞TNF-α、IL-1β、TGF-β1分泌。將pTRAF6-shRNA1轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞后,TNF-α、IL-1β、TGF-β1增長率均明顯低于陰性對照組和空白對照組(P0.01)。Realtime PCR檢測結(jié)果顯示,pTRAF6-shRNA1組IL-6、COX-2 mRNA表達明顯下調(diào),與正常對照組比較有顯著差異。Western blot結(jié)果表明,pTRAF6-shRNA1組細胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達明顯減少。 結(jié)論重組質(zhì)粒pTRAF6-shRNA可能通過抑制LPS誘導的NF-κB p65核轉(zhuǎn)位,降低相關(guān)炎癥細胞因子和介質(zhì)的分泌,抑制RAW264.7細胞內(nèi)毒素炎癥反應。 第四部分TRAF6siRNA對急性肝衰竭內(nèi)毒素炎癥小鼠的保護作用 實驗一不同轉(zhuǎn)染方式對GFP表達質(zhì)粒在小鼠肝臟的表達影響 目的：研究經(jīng)流體力學注射、門靜脈和腹腔常規(guī)注射3種不同途徑注射GFP表達質(zhì)粒后,目的基因在小鼠肝臟的表達情況及其轉(zhuǎn)基因效率。 方法：將裸質(zhì)�；蛑|(zhì)體包裹的質(zhì)粒DNA分別應用流體力學注射、門靜脈及腹腔常規(guī)注射法注入同種異體小鼠體內(nèi),48 h后分別取血和肝組織,常規(guī)生化方法檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和總膽紅素(TB),HE染色檢測肝組織病理變化,新鮮組織冰凍切片觀察3種轉(zhuǎn)染途徑對質(zhì)粒DNA在小鼠肝臟的表達影響。 結(jié)果：注射48 h后,腹腔常規(guī)注射組與正常組比較,ALT和TB的升高幅度較小,與流體力學注射組比較該差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),且各組內(nèi)脂質(zhì)體復合物組與裸質(zhì)粒組比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。常規(guī)石蠟切片HE染色顯示,HI組及PV組小鼠肝細胞輕度水腫,各組內(nèi)裸質(zhì)粒組和脂質(zhì)體復合物組之間無明顯差異。流體力學注射組及門靜脈常規(guī)注射組均可見大量綠色熒光蛋白表達,兩組的熒光表達量差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),腹腔注射組小鼠的肝臟僅見少量的綠色熒光表達,但三組內(nèi)脂質(zhì)體／質(zhì)粒DNA復合物組綠色熒光表達量均明顯高于裸質(zhì)粒組(P0.05)。 結(jié)論：應用流體力學注射及門靜脈常規(guī)注射脂質(zhì)體／質(zhì)粒DNA復合物途徑,目的基因均在小鼠肝臟高效表達,兩種途徑無明顯差異,流體力學注射可廣泛用于肝靶向性的活體基因轉(zhuǎn)染。 實驗二TRAF6siRNA對急性肝衰竭內(nèi)毒素炎癥小鼠的保護作用 目的：研究TRAF6沉默基因?qū)PS/D-GalN誘導的急性肝衰竭內(nèi)毒素炎癥小鼠的作用及其可能的機制。 方法：BALB/c小鼠隨機分為正常對照組、急性肝衰竭(ALF)模型組、陽性對照(姜黃素)組、陰性對照(空白質(zhì)粒)組和RNAi(pTRAF6-shRNA1)組。采用流體力學注射法將pTRAF6-shRNA1表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠,24 h后重復注射一次。第二次注射后24 h,予LPS(20μg/kg)聯(lián)合D-氨基半乳糖(D-GalN,600 mg/kg)制做急性肝衰竭內(nèi)毒素炎癥模型。觀察小鼠存活率,并于造模后16 h,采用常規(guī)生化方法血清ALT、AST,免疫組化染色檢測iNOS和NF-κB p65在肝細胞的表達；Realtime-PCR檢測TRAF6、IL-6、COX-2及NF-κB p65 mRNA的表達；Western blot檢測總蛋白和細胞核內(nèi)NF-κB p65的表達；造模后4、8、16 h,ELISA檢測血清TNF-α、IL-1β及TGF-β1水平變化。 結(jié)果：熒光顯微鏡觀察顯示真核表達質(zhì)粒pTRAF6-shRNA1成功轉(zhuǎn)染進入小鼠肝組織。pTRAF6-shRNA1可明顯抑制小鼠肝組織TRAF6 mRNA和TRAF6蛋白表達(P0.01),其中TRAF6 mRNA表達抑制率為60.13%, TRAF6蛋白抑制率為52.08%,與正常小鼠比較均有顯著性差異(P0.01)。LPS/D-GalN腹腔注射16 h后,小鼠血清ALT、AST水平及肝組織病理學檢測顯示造模成功。RNAi (pTRAF6-shRNA1)組小鼠72h的存活率為49.3%,高于其它組(姜黃素組為36.2%). pTRAF6-shRNA1可明顯降低小鼠血清ALT和AST水平,與ALF模型組比較有顯著意義(P0.01)。Realtime-PCR結(jié)果顯示RNAi組小鼠IL-6、COX-2及NF-κB p65 mRNA表達下降,與ALF模型組比較有顯著意義(P0.01)。ELISA檢測顯示RNAi組小鼠血漿TNF-α、IL-1β及TGF-β1水平上調(diào),但始終明顯低于同時間點ALF模型組,TNF-α、IL-1p于8 h達到峰值,TGF-β1于16 h達到峰值。免疫組化染色顯示RNAi組iNOS蛋白表達較ALF模型組降低。姜黃素組與RNAi組比較無顯著差異(P0.05),姜黃素有降低轉(zhuǎn)氨酶,對阻止TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2及iNOS升高有一定作用。Western blot技術(shù)顯示ALF模型組小鼠肝組織中總蛋白和胞核NF-κB p65表達均增加；pTRAF6-shRNA1組小鼠肝組織總蛋白NF-κB p65表達水平顯著高于正常組小鼠總蛋白NF-κB p65水平(P0.01),但較ALF模型組比較無明顯變化(P0.05),胞核NF-κB p65明顯降低,與ALF模型組比較有顯著性差異(P0.05)。結(jié)果提示TRAF6基因沉默,不僅能降低細胞NF-κB p65表達水平,還能明顯抑制NF-κB p65核轉(zhuǎn)位。 結(jié)論：pTRAF6-shRNA1可能通過下調(diào)NF-κB p65水平,抑制炎癥相關(guān)細胞因子和炎性介質(zhì)表達水平,從而減輕內(nèi)毒素／半乳糖誘導的小鼠急性肝損傷。
【學位單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2010
【中圖分類】：R575.3
【部分圖文】：

圖1LPS/TLR4介導的信號傳導通路治療急性肝衰竭過度炎癥反應的研究重點。死因子受體相關(guān)因子一6[翎F(tumourneerosisfaetor)一rec即tRAF6』作為介導NF一KB信號轉(zhuǎn)導的一個關(guān)鍵銜接蛋白，在TL側(cè)中的發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[8，9]。TRAF6既可激活NF一沼誘導inase，NIK)，同時，又可激活絲裂素活化蛋白激酶/ERK激酶激proteinkinase/ERKkinasekinasel，MEKKI)，是髓樣分化因子ionracto:58，MyD8s)依賴性信號轉(zhuǎn)導途徑主要蛋白分子(見圖TRAF6缺失小鼠明顯降低LPs誘導的NF一沼和誘生型No合成一1和IL一18信號傳導障礙，機體對LPS低反應。他們還發(fā)現(xiàn)TR能完全阻止LPS誘導的JNK活化。Katie等也發(fā)現(xiàn)TRAF6基s誘導的e一Jun氨基末端激酶(c一Junamino一terminalkinase，JNK)

接種RAW264.7細胞4h后細胞貼壁。第3天，倒置顯微鏡下觀察，可見多數(shù)細胞有明顯“偽足”伸出，大小不一，主要為圓形、橢圓形或梭形，細胞生長較快，按l:3傳代第3天匯合率達90%以上(見圖1一l)。細胞活力和活性均在90%以上。圖1一1傳代第3天的RAW264.7細胞 (X200)2各組細胞活力檢測結(jié)果LpS刺激后，RAW264.7活化，形態(tài)發(fā)生改變(圖l一3)。LPs刺激后Zh、4h、sh和16h，MTT摻入法檢測各組細胞存活率，結(jié)果顯示:LPS組和姜黃素(Cur)組細胞存活率略有增加，地塞米松(DM)組細胞存活率略有減少，但比較各組細胞存活率無統(tǒng)計學差異(幾0.05)(圖l一2)。 hhhaaa.，‘吸.叻

接種RAW264.7細胞4h后細胞貼壁。第3天，倒置顯微鏡下觀察，可見多數(shù)細胞有明顯“偽足”伸出，大小不一，主要為圓形、橢圓形或梭形，細胞生長較快，按l:3傳代第3天匯合率達90%以上(見圖1一l)。細胞活力和活性均在90%以上。圖1一1傳代第3天的RAW264.7細胞 (X200)2各組細胞活力檢測結(jié)果LpS刺激后，RAW264.7活化，形態(tài)發(fā)生改變(圖l一3)。LPs刺激后Zh、4h、sh和16h，MTT摻入法檢測各組細胞存活率，結(jié)果顯示:LPS組和姜黃素(Cur)組細胞存活率略有增加，地塞米松(DM)組細胞存活率略有減少，但比較各組細胞存活率無統(tǒng)計學差異(幾0.05)(圖l一2)。 hhhaaa.，‘吸.叻

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本文編號：2819208