發(fā)布時(shí)間：2020-09-12 12:56

　　 背景： 肝纖維化（hepatic fibrosis, HF）是肝臟對不同病因所致的慢性肝臟疾病的病理學(xué)綜合征,是各種慢性肝病發(fā)展的必經(jīng)階段。在整個(gè)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中，肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells, HSCs）的激活是一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)�；罨腍SCs能過量表達(dá)α-平滑肌肌動蛋白（Alpha smooth muscle actin，α-SMA）并合成異常增多的細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Cell Matrix，ECM）超過肝臟的代謝能力從而導(dǎo)致其在肝內(nèi)大量聚集。HSCs活化的初始階段主要是由鄰近細(xì)胞(如肝細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞等)通過旁分泌作用啟動的。此外，HSCs還可分泌一些細(xì)胞因子促進(jìn)Kupffer細(xì)胞激活以及通過自分泌或者旁分泌促進(jìn)自身進(jìn)一步激活。 小泛素樣分子相關(guān)修飾物（small ubiquitin-like modifier, SUMO）是一種類泛素樣蛋白，與泛素(ubiquitin)泛素介導(dǎo)的蛋白降解途徑不同，SUMO化的結(jié)果并不是將靶蛋白降解，而是通過修飾來增強(qiáng)它們的穩(wěn)定性或者調(diào)節(jié)其亞細(xì)胞定位及影響其轉(zhuǎn)錄活性，從而發(fā)揮更加廣泛的作用。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)隨著肝纖維化的進(jìn)展，SUMO-1的表達(dá)量逐漸增加。SUMO-1可能通過增強(qiáng)TGF-β1及PDGF的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)HSC的增殖和活化，促進(jìn)其分泌膠原，表現(xiàn)出促肝纖維化作用。SUMO化修飾過程需要多種酶參與，但只有唯一的接合酶-ubc9。因此，我們推斷ubc9可能通過調(diào)節(jié)SUMO化參與肝纖維化甚至肝癌的發(fā)生發(fā)展。為進(jìn)一步研究ubc9在肝纖維化過程中的作用及其機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)首先利用RT-PCR和Western blot檢測正常肝細(xì)胞株L02、人源性肝星狀細(xì)胞株LX-2和肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC-7721內(nèi)ubc9的表達(dá)量。再將pcDNA6.2-mir ubc9瞬時(shí)轉(zhuǎn)染LX-2，以Western blot方法檢測轉(zhuǎn)染前后LX-2細(xì)胞內(nèi)ubc9、α-SMA、IKBα、p65及Bcl-2等基因的表達(dá)情況，以ELISA分析轉(zhuǎn)染前后LX-2細(xì)胞分泌TNF-α與IL-6的變化，以流式細(xì)胞術(shù)分析轉(zhuǎn)染前后LX-2細(xì)胞凋亡與周期的變化情況。以期闡明ubc9在肝纖維化中的作用機(jī)制。 目的： 探討ubc9在LX-2細(xì)胞活化與增殖過程中的作用及其機(jī)制 方法： 分別在體外培養(yǎng)正常肝細(xì)胞株L02、肝星狀細(xì)胞株LX-2和肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC-7721后提取RNA及蛋白質(zhì)，再利用RT-PCR及western blot檢測ubc9的表達(dá)水平；將人工合成的針對ubc9基因的pcDNA6.2-mir ubc9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LX-2，采用RT-PCR及western blot方法檢測轉(zhuǎn)染后LX-2中ubc9的表達(dá)變化，以westernblot方法檢測轉(zhuǎn)染后LX-2中α-SMA、IKBα、p65及Bcl-2的表達(dá)變化，以ELISA分析轉(zhuǎn)染前后LX-2細(xì)胞分泌TNF-α與IL-6的變化，以流式方法檢測各實(shí)驗(yàn)組LX-2細(xì)胞的周期及凋亡。 結(jié)果： RT-PCR與Western blot檢測發(fā)現(xiàn)正常肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞和肝癌細(xì)胞內(nèi)均會表達(dá)ubc9基因；人工合成的針對ubc9基因的pcDNA6.2-mir ubc9質(zhì)粒能抑制LX-2細(xì)胞中ubc9、α-SMA、p65及Bcl-2基因的表達(dá)，同時(shí)能增加IKBα的表達(dá)，與對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 0.05）。轉(zhuǎn)染后LX-2的周期被阻滯在G2/M期，并且能夠促進(jìn)LX-2的凋亡，與對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。以上結(jié)果說明，下調(diào)ubc9能夠抑制LX-2的增殖。 結(jié)論： 1. ubc9可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2的表達(dá)而參與肝星狀細(xì)胞的凋亡過程； 2. ubc9可能通過作用于IKBα及p65調(diào)控NF-κB信號通路從而參與肝纖維化的過程。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2014
【中圖分類】：R575.2
【部分圖文】：

圖 5 各組細(xì)胞中 ubc9 mRNA 的表達(dá)量Fig.5 Expression of ubc9 mRNA in each group; b The bargraph represents the mean± standard deviation of thp.A: L02 group; B:LX-2 group; C:HepG2 group; D: SMMC7 mRNAexpression of ubc9 in cells of each group (RGS,xA B C 0.31±0.03 0.58±0.04 0.77±0.07 GS, relative gray scales.X-2 group; C:HepG2 group; D:SMMC-7721 group. blot 檢測分析 LX-2 細(xì)胞內(nèi) ubc9 的表達(dá)水平2、HepG2、SMMC-7721 細(xì)胞內(nèi)均會表達(dá) ubc9 蛋白

第 3 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 5 Protein expression of ubc9 in cells of each group (RGS,xA B C 0.42±0.06 0.77±0.07 0.89±0.08 GS, relative gray scales. LX-2 group; C: HepG2 group; D: SMMC-7721 group. 檢測分析 mir ubc9 沉默 ubc9 的效果相比，人工合成的針對 ubc9 基因的 miRNA 質(zhì)粒能X2 中 ubc9 基因的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.3 與 Table 6）

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 肖志華;郭武華;張吉翔;;SUMO-1在實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化形成過程中的作用[J];世界華人消化雜志;2010年14期

2 郭武華;袁麗華;肖志華;張吉翔;;SUMO-1基因在肝癌中的表達(dá)及意義[J];重慶醫(yī)學(xué);2009年24期

3 趙珍東;黃兆勝;;姜黃素對HSC PDGF-BB、PDGFRβ及ERK_1表達(dá)的影響[J];中藥材;2009年05期

本文編號：2817656