目的：Wnt信號轉導通路是近年來分子生物學、細胞生物學和腫瘤研究中的一大熱點,參與了胚胎發(fā)育及成體組織細胞增殖、分化及凋亡等調(diào)控過程。Wnt信號通路的異�；罨c腎、肺、肝、心臟以及皮膚等組織器官纖維化的發(fā)生與進展關系密切。本研究采用肝星狀細胞株體外培養(yǎng),MTT, VG染色,ELISA, Western Blotting等檢測方法,探討Wnt與TGF-β信號通路在乙醛刺激肝星狀細胞活化中交叉對話(crosstalk)的可能機理,然后從肝星狀細胞活化程度的角度觀察兩條通路crosstalk的功能效應。首先,乙醛刺激HSC細胞株,通過VG染色法從形態(tài)學角度觀察HSC活化程度；MTT法檢測活化的HSC的增殖程度；ELISA法測定HSC內(nèi)膠原蛋白Ⅰ以及纖維粘連素FN含量,證明乙醛能有效刺激肝星狀細胞株活化。接著采用SB-431542特異性阻斷TGF-β信號通路,Western blotting檢測Wnt信號通路下游產(chǎn)物β-catenin的磷酸化水平；TDZD-8特異性阻斷GSK-3β,進一步激活Wnt途徑,Western bloting檢測TGF-β通路中Smad3的磷酸化狀態(tài)；同時使用SB-431542和TDZD-8檢測β-catenin以及Smad3的磷酸化,以分析兩通路可能存在的crosstalk。方法：(1)HSC-T6細胞株分為未處理組(陰性對照組),乙醛激活組(陽性對照組),TDZD-8處理組(Wnt激活對照組),乙醛激活+TDZD-8處理組(Wnt激活組),乙醛激活+SB-431542處理組(TGF-β通路抑制組,而Wnt途徑激活),乙醛激活+SB-431542+TDZD-8處理(Wnt途徑進一步激活而TGF-β通路抑制)。各組細胞培養(yǎng)至融合度70%-80%時,0.4%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基同步化處理細胞12h后,更換為10%胎牛血清DMEM完全培養(yǎng)基。對照組用對應的抑制劑處理培養(yǎng),刺激組在對應的抑制劑預處理1h后給予乙醛刺激(終濃度200gmol/L)刺激,每12h補加一次,刺激24h。之后提取細胞總蛋白,G250法測定蛋白含量,SDS-PAGE電泳分離,Western Blotting檢測各目的蛋白含量,檢測指標包括：Wnt途徑下游產(chǎn)物總β-catenin,磷酸化β-catenin, TGF-β途徑總smad3,磷酸化的p-smad3-S425,磷酸化的p-smad3-S204。根據(jù)Western印跡膜上蛋白條帶灰度,采用Quantity One分析軟件進行處理,對不同受體拮抗劑或激活劑作用后各蛋白磷酸化水平的改變進行分析。(2)分組同(1),所有細胞均在6孔板中爬片,細胞處理方案同(1),待處理完畢,將細胞爬片做VG染色,顯微鏡下觀察及照相。細胞培養(yǎng)上清液做ELISA檢測纖維粘連素FN和膠原蛋白Ⅰ含量變化。(3)將96孔板接種HSC-T6細胞株,分組同(1),每組設3復孔,細胞處理方法同(1),光鏡下觀察細胞生長狀況,MTT法檢測細胞活性。結果：(1)乙醛激活HSC細胞株后,MTT法檢測細胞增值活性明顯上升,ELLSA檢測出纖維粘連素FN和膠原蛋白Ⅰ以及平滑肌動蛋白α-SMA含量均有不同程度的增多,VG染色示膠原含量增多,說明酒精的代謝產(chǎn)物乙醛對肝星狀細胞的活化有明顯的刺激作用。(2)使用Wnt途徑激活劑TDZD-8 (GSK-3β特異性阻斷劑)激活Wnt途徑后,Wnt途徑下游產(chǎn)物β-catenin表達無明顯變化,但p-β-catenin水平下降；在另一組使用SB431542阻斷TGF-β通路,下游產(chǎn)物β-catenin無明顯變化,p-β-catenin水平也下降；使用TDZD-8和SB431542同時阻斷TGF-β通路,激活Wnt途徑,β-catenin表達量無明顯變化,p-β-catenin水平明顯下降。(3)使用Wnt途徑激活劑TDZD-8(GSK-3β特異性阻斷劑)激活Wnt途徑后,TGF-β途徑的關鍵因子Smad3的S425和S204磷酸化水平并無明顯變化；使用SB431542阻斷TGF-β途徑后S425和S204表達都明顯降低；同時使用TDZD-8和SB431542,S425和S204水平降低但降幅不如單阻斷TGF-β途徑。結論：(1)乙醛激活HSC細胞后,可以使HSC細胞進一步活化,其分泌產(chǎn)物Ⅰ型膠原蛋白及纖維粘連素明顯增多,細胞增殖并轉分化。(2)在乙醛激活的肝星狀細胞中,TGF-β信號通路的抑制可導致Wnt信號通路的激活,因此TGF-β信號通路對Wnt信號通路具有抑制效應。(3)乙醛可導致肝星狀細胞TGF-β信號通路激活,且Wnt與TGF-β兩條信號通路之間存在"crosstalk",Wnt信號通路對Smad3的S425和S204的磷酸化修飾具有拮抗效應。
【學位單位】：瀘州醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2010
【中圖分類】：R575.2
【部分圖文】：

*::與對照組比較P<0.05，差異有顯著性 1.4westernblotting檢測a一sMA表達量改變比較對照組和乙醛激活組a一SMA蛋白印跡條帶，如圖4可見在乙醛激活的肝星狀細胞中a一SMA的表達有明顯增加。一戶us。祠u一。>一一代芝叩花巴。對照組乙醛激活組 48h72h48h72h以一SMATubulinAeetaldehydeHOUTS 48724872圖4乙醛激活的肝星狀細胞中a一SMA表達量的 westemblotting檢測 Fig4Westemblottingdeteetionofa一 SMAinHSC一 T6eellsaetivatedbyacetaldehyde

通路激活和Wnt信號通路抑制，且Wni與TGF一p兩條信號通路之間存在“crosstalk”，Wnt信號通路對Smad3的5425和5204位點的磷酸化修飾具有拮抗作用(圖6，表6)。ConirolsAeetaldehyde一aetivatedAeetaldehydeSB一 431542一+一+十+++TDZD一8P一Smad3一5425P一Smad3一5204 TotalSmad3TubUlifi

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