炎癥性腸�。↖nflammatory bowel disease，IBD）包括潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）和克羅恩病(Crohn’s disease，CD)，近年來在我國發(fā)病率逐年增多，其診斷和治療方面依然存在許多難點。由于在我國腸結(jié)核（Intestinal tuberculosis，ITB）的發(fā)病率仍然很高，部分CD與ITB患者在臨床表現(xiàn)、內(nèi)鏡及病理學(xué)改變方面極為相似，雖然目前國內(nèi)外已有多種檢查方法來區(qū)分兩者，但鑒別診斷依然十分困難。 結(jié)核感染T細胞斑點試驗（T-SPOT.TB）是目前診斷活動性結(jié)核感染最有價值的一種檢查方法，通過結(jié)核桿菌特異性抗原CFP-10、ESAT-6的刺激后，患者外周血中被致敏的單個核細胞特異性地釋放γ-干擾素，然后通過固像免疫顯色形成沉淀斑點，從而判斷是否存在隱性或現(xiàn)癥感染結(jié)核。在目前臨床應(yīng)用中，國外報道中T-SPOT.TB檢測的敏感性和特異性能達到95%以上[1]，因此正逐漸得以推廣。T-SPOT.TB技術(shù)是一個已經(jīng)證實為很好的診斷結(jié)核的方法，但該技術(shù)在鑒別CD和ITB上仍無更多相關(guān)研究。我們首先探索了該技術(shù)在鑒別CD和ITB中的價值，結(jié)果提示T-SPOT.TB可很好區(qū)分明顯活動性CD和ITB，但對活動程度較輕和緩解期的CD和ITB鑒別仍有困難。 目前研究發(fā)現(xiàn)，microRNA （miRNA）在CD與UC中有作為分子標(biāo)志鑒別診斷的作用，而且已經(jīng)證實不同的miRNA在多種腫瘤中可作為分子標(biāo)志物用以鑒別不同部位腫瘤，IBD組織中也有相對特異性的miRNA表達，是否在CD和ITB患者單個核細胞中存在不同的miRNA呢？經(jīng)特異性結(jié)核抗原刺激后的CD和ITB患者單個核細胞中是否存在miRNA表達的差異呢？目前少見通過對比CD與ITB患者miRNA表達差異進行鑒別診斷的研究報道。我們通過對CD和ITB患者外周血單個核細胞受到結(jié)核特異性抗原CFP-10、ESAT-6刺激后所產(chǎn)生miRNA進行miRNA芯片表達譜分析，對差異表達的miRNA進一步在CD和ITB患者腸道手術(shù)病理組織中進行驗證，以期在兩種病變組織中找到有鑒別診斷價值的特異性miRNA，為鑒別診斷這兩種疾病提供新的分子標(biāo)志。 目的 1．應(yīng)用T-SPOT.TB方法研究該方法在鑒別診斷CD與ITB中的價值。 2．比較CD與ITB患者外周血單個核細胞經(jīng)特異性結(jié)核抗原CFP-10、ESAT-6刺激后的miRNA表達譜。 3．應(yīng)用Real-time PCR方法在CD和ITB患者腸道病變組織中驗證差異表達的miRNA。 方法 1．采集CD與ITB及腸外結(jié)核患者的外周血標(biāo)本共126例，進行T-SPOT.TB檢測； 2．以正常自愿者作為對照，采集3例正常自愿者、3例活動期CD與3例活動期ITB患者外周血分離提取單個核細胞，分別給予特異性結(jié)核抗原CFP-10以及ESAT-6刺激后培養(yǎng)；將兩組培養(yǎng)后的細胞以正常自愿者組作為對照，進行miRNA芯片分析篩選； 3．應(yīng)用生物信息學(xué)進行分析miRNA表達譜，找出表達有明顯統(tǒng)計學(xué)意義的差異miRNA； 4．對表達差異的miRNA分別在5例正常人、5例CD和5例ITB腸組織標(biāo)本中進行Real－time PCR驗證。 結(jié)果 1．確診CD患者15例[11.9%（15/126）]，ITB患者14例[11.1%（14/126）]，腸外結(jié)核患者40例[31.7%（40/126）]。CD、ITB、腸外結(jié)核、其他疾病患者T-SPOT.TB陽性率分別為6.7%（1/15）、85.7%（12/14）、70%（28/40）、0%（0/57），各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001）。CD與ITB患者的T-SPOT.TB陽性率間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=70.58，P=0.001）。T-SPOT.TB檢測CD敏感性和特異性分別為93.3%（14/15）和87.5%（14/16），檢測ITB時則分別為85.7%（12/14）和93.3%（14/15），CD的陰性預(yù)測值[87.5%（14/16）]高于ITB的陰性預(yù)測值[12.5%（2/16）]。以上結(jié)果提示T-SPOT.TB診斷TB的敏感性與特異性高，其有助于鑒別診斷CD和ITB。 2．提取3例正常人、確診的3例活動期CD和3例活動期ITB患者外周血單個核細胞分為三組，其中3例正常人、確診的3例活動期CD患者均進行T-SPOT.TB檢測均為陰性，3例活動期ITB患者進行T-SPOT.TB檢測均為強陽性。三組外周血單個核細胞經(jīng)特異性結(jié)核抗原CFP-10、ESAT-6刺激后進行miRNA芯片分析篩選，miRNA表達譜結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD與ITB對比，上調(diào)的miRNA有12個，下調(diào)的miRNA有10個，經(jīng)抗原刺激后的CD與ITB對比，上調(diào)的miRNA有9個，下調(diào)miRNA的有1個，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析靶基因與差異miRNA的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，上調(diào)與下調(diào)的miRNA分別有7個。最后綜合分析后得到差異最顯著的miRNA有5個，分別是miR-125b、miR-31、miR-19b、miR-939、miR-144。 3．Real-time PCR驗證結(jié)果提示：miR-31、miR-19b、miR-939、miR-144在CD與ITB中對比并無明顯差異，而miR-125b在CD和ITB組織的表達中有明顯差異，在正常對照中,miR-125b均值=1.001，在ITB中miR-125b均值=1.161，CD中miR-125b均值=0.679，miR-125b在ITB中表達量水平明顯高于CD組織，P0.01，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析有顯著意義。 結(jié)論 1．T-SPOT.TB是活動性CD和ITB有效的鑒別診斷方法。 2．miR-125b在CD和ITB組織中表達有顯著差異，miR-125b表達在ITB中顯著高于對照，在CD中表達顯著低于正常對照，miR-125b在ITB中的表達量明顯高于CD，認為miR-125b可作為CD和ITB腸道病變組織中鑒別診斷的重要分子標(biāo)志。
【學(xué)位單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2012
【中圖分類】：R574.62;R524

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本文編號：2816726