【背景】 缺血再灌注損傷(Ischemia reperfusion injury IRI)是指組織器官缺血后再灌注不僅不能改善組織器官功能恢復,反而加重組織器官的功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷。在心肌缺血、腦卒中、創(chuàng)傷等疾病病理過程中都可發(fā)生IRI。肝臟IRI是肝臟外科最常見的病理過程,多見于休克、需要阻斷肝臟血流的肝外科手術(shù)以及肝移植術(shù)等病理生理過程中,研究證實有10%的早期肝移植失敗都是由于IRI造成,也是引起肝移植術(shù)后急慢性排斥反應的重要因素。目前關(guān)于肝臟IRI機制的研究將該病理過程分為兩個階段,早期,多為再灌注后6 h以內(nèi),以氧化應激產(chǎn)生大量活性氧族(Reactive oxygen species ROS)直接損傷肝細胞引起肝細胞凋亡壞死為主要特征;后期,以炎細胞浸潤釋放大量炎癥相關(guān)因子,進一步放大炎癥反應,直接或間接引起肝臟細胞凋亡壞死為特征。 經(jīng)典Notch信號途徑在進化上高度保守,研究證實Notch信號途徑廣泛參與細胞增殖、細胞凋亡及細胞命運決定。在哺乳動物,經(jīng)典Notch信號通路由5種配體(Jagged1, 2, and Delta-like [Dll] 1, 3,and 4)和4種受體(Notch1-4)組成,當配體與受體結(jié)合,Notch信號被激活,在??分泌酶(GSI)的酶切作用下,受體胞內(nèi)段?(Notch intracellular domain NICD)被剪切,入核,與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子?RBP-J (recombination signal binding protein J?)?結(jié)合,啟動下游基因如包括Hes家族在內(nèi)的堿性螺旋環(huán)螺旋因子的表達,進而引發(fā)后續(xù)分子事件。近年有報道證實,Notch信號參與了細胞對于外界刺激的應答,在心、腦缺血性損傷中都有Notch信號途徑的參與。Notch信號是否參與肝臟IRI過程?Notch信號在肝臟IRI中的作用如何?Notch信號在肝臟IRI中發(fā)揮作用的分子機制是什么?這些問題的闡明將為IRI相關(guān)的研究開辟新的領(lǐng)域,進一步完善肝臟IRI分子調(diào)控理論體系,為肝臟IRI的預防和治療提供理論基礎(chǔ)。 【目的】 研究Notch信號通路在肝臟IRI中的作用,作用的細胞生物學基礎(chǔ)及分子機制,探索肝臟IRI新的分子調(diào)控機制,為肝臟IRI的預防和治療提供新的理論依據(jù)。 【方法】 1.以無創(chuàng)動脈夾夾閉小鼠肝臟左葉、中葉血供90 min,制造小鼠肝臟IRI模型,利用Real-time PCR檢測Notch信號通路相關(guān)分子在肝臟IRI中的表達變化,利用Western blot檢測Notch1受體胞內(nèi)段的表達水平。 2.利用PCR方法鑒定小鼠基因型,獲得Mx-Cre-RBP-Jf/f純合子小鼠及Mx-Cre-RBP-Jf/+雜合子對照小鼠,PolyI-PolyC誘導,在純合子小鼠中剔除RBP-J基因,實現(xiàn)阻斷Notch信號。通過檢測血清ALT、AST水平,組織學HE染色,TUNEL凋亡染色,MPO免疫組織化學,流式細胞儀檢測相關(guān)炎性細胞浸潤情況,Real-time PCR檢測炎癥因子表達水平,觀察阻斷Notch信號對肝臟IRI的影響。 3.通過分別將RBP-J剔除和對照小鼠全骨髓細胞移植給致死劑量照射的野生型小鼠,獲得在骨髓細胞特異剔除RBP-J小鼠及對照小鼠,行肝臟IRI造模,通過血清ALT、AST檢測、組織學HE染色、TUNEL凋亡染色,觀察骨髓細胞阻斷Notch信號對肝臟IRI的影響。 4.體外應用GSI阻斷Notch信號,利用肝細胞體外缺氧(0.5%)培養(yǎng)15 h,正常培養(yǎng)基常氧培養(yǎng)6 h,模擬IRI,通過TUNEL凋亡染色,Casepase3 mRNA水平檢,損傷后剩余活細胞計數(shù),條件培養(yǎng)基刺激巨噬細胞后Elisa檢測TNFα水平,觀察肝細胞阻斷Notch信號對IRI的影響。 5.利用DCFH-DA探針結(jié)合流式細胞技術(shù)檢測細胞內(nèi)ROS水平,利用Real-time PCR檢測iNOS、抗凋亡蛋白Bcl-xl mRNA表達水平,Western blot檢測iNOS蛋白表達水平,觀察阻斷Notch信號對肝臟IRI肝細胞內(nèi)ROS水平的影響,并利用ROS清除劑觀察ROS在Notch信號調(diào)控肝臟IRI中的作用。 6.利用Real-time PCR檢測MnSOD mRNA表達水平,Western blot檢測MnSOD、磷酸化STAT3、磷酸化Akt蛋白表達水平,利用免疫共沉淀檢測Hes5與STAT3蛋白相互作用,通過過表達持續(xù)激活STAT3觀察STAT3在Notch調(diào)控肝臟IRI中的作用,從而揭示Notch信號通路調(diào)控肝臟IRI中肝細胞ROS的分子機制。 7.通過將肝細胞與過表達Notch配體Dll1 OP-9細胞共培養(yǎng)或過表達Hes5激活Notch信號,觀察激活Notch信號對肝細胞IRI的影響。 【結(jié)果】 1.在肝臟IRI中伴隨著Notch信號途徑的廣泛激活及下游分子的表達上調(diào):在肝臟IRI中,Notch1、Notch2、Dll4、Jagged2、Hes5 mRNA表達上調(diào)、NICD蛋白表達明顯上調(diào)。 2.阻斷Notch信號會導致肝臟IRI加重。表現(xiàn)為:血清ALT、AST水平升高;肝細胞凋亡、壞死增加;中性粒細胞、T細胞、巨噬細胞浸潤增加,炎癥因子TNFα、IL1β、IL6、IFNγ,趨化因子CCL3,粘附分子ICAM1產(chǎn)生增加。 3.阻斷Notch信號引起肝臟IRI中肝細胞細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增加,并且,應用ROS清除劑可以挽救Notch信號阻斷引起的血清ALT、AST升高,肝細胞凋亡壞死增加,說明Notch信號阻斷引起肝細胞內(nèi)ROS水平升高,最終導致IRI加重。 4.進一步分子機制的研究證實:阻斷Notch信號導致下游分子Hes5表達下調(diào)使得Hes5-STAT3復合物形成障礙,導致STAT3磷酸化水平下降,引起MnSOD表達下調(diào),最終導致細胞內(nèi)ROS水平升高,過表達持續(xù)激活STAT3可以上調(diào)MnSOD表達,降低細胞內(nèi)ROS水平,挽救IRI中Notch信號阻斷引起的細胞凋亡增加。 5.體外配體激活Notch或過表達Hes5對肝細胞IRI起到保護性作用,表現(xiàn)為細胞內(nèi)ROS水平下降,細胞凋亡減少。我們的研究結(jié)果說明,經(jīng)典Notch信號途徑通過其下游分子Hes5協(xié)助STAT3的激活,進而引起MnSOD表達上調(diào),降低細胞內(nèi)ROS水平,在IRI中對肝細胞起到保護性作用。 【結(jié)論】 1. Notch信號通路在肝臟IRI中發(fā)揮重要作用,Notch信號缺失會引起肝臟IRI加重。 2.肝細胞是Notch信號調(diào)控肝臟IRI的細胞生物學基礎(chǔ),在骨髓細胞中阻斷Notch信號對肝臟IRI無明顯影響,肝細胞中阻斷Notch信號引起IRI肝細胞凋亡增加。 3. Notch信號通過調(diào)控肝臟IRI中肝細胞內(nèi)ROS水平影響肝臟IRI,Notch信號缺失引起肝臟IRI中肝細胞ROS水平升高。 4. Notch信號通過其下游分子Hes5影響STAT3的激活,進而調(diào)控MnSOD的表達,最終影響細胞內(nèi)ROS水平,Notch信號缺失引起Hes5-STAT3復合物水平下降,MnSOD表達下調(diào),ROS清除減少。 5.體外激活肝細胞Notch信號對IRI起到保護性作用,激活肝細胞Notch信號引起IRI細胞凋亡減少。 眾多細胞、分子參與了肝臟IRI的調(diào)控,而我們的研究發(fā)現(xiàn)Notch信號途徑通過Hes5影響STAT3的激活調(diào)控MnSOD的表達對肝臟IRI發(fā)揮保護性作用。我們首次報道了Notch-Hes5-STAT3-MnSOD分子調(diào)控軸,開辟了肝臟IRI分子調(diào)控機制研究的新的領(lǐng)域,為肝臟IRI的臨床預防和治療提供理論基礎(chǔ),同時也為眾多ROS相關(guān)疾病,如:腫瘤、自身免疫性疾病的相關(guān)研究提供了新的思路。
【學位單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2011
【中圖分類】：R575
【部分圖文】：

圖 1. 細胞內(nèi) ROS 的產(chǎn)生和清除機制② ROS 的損傷作用細胞內(nèi)蓄積的過多的 ROS 可以直接損傷細胞，其損傷機制包括：（OS 對細胞膜雙層磷脂結(jié)構(gòu)中重要脂類進行氧化作用，改變膜的完整性和性，生成多種毒性很強的脂質(zhì)過氧化物，從而直接損傷細胞；（2）ROS直接氧化肝細胞核內(nèi) DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)，引起 DNA 突變而造成肝臟結(jié)功能的損傷[54, 55]；（3）ROS 通過直接作用于肝竇內(nèi)皮細胞膜增加血及中性粒細胞的粘附位點和激活磷脂酶 A2 催化膜表面的磷脂成分產(chǎn)小板激活因子及白三烯，對肝竇內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)和功能進行破壞而損傷肝；（4）ROS 抑制線粒體的氧化磷酸化，使能量物質(zhì)減少；（5）ROS引發(fā)一系列復雜的生物活性分子的產(chǎn)生和反應，如吞噬細胞激活、內(nèi)毒釋放、補體激活、花生四烯酸代謝激活(生成前列腺素、血栓素)等而造

等在應激狀況下都可以表達 iNOS，肝臟 IRI 過程中 NF-κB 激活下游 iNOS 的表達[75]。應激狀況下 iNOS 產(chǎn)生的 NO 遠遠多S, 因此，iNOS 是肝臟 IRI 中 NO 的主要來源。關(guān)于 NO 在肝臟 I作用尚存在爭議，一方面，NO 具有舒張血管，改善微循環(huán)的作用，肝臟損傷起到保護性作用[76]。另一方面 NO 在大量氧自由基存在下氧化成過氧亞硝酸（ONOO-），可以直接使蛋白發(fā)生硝基化，直接損，是效價很高的細胞凋亡誘導劑[77]。此外，Takashi, H. [78]證實，iNO的 NO 對于 MMP-9 的活化至關(guān)重要，iNOS 的剔除會導致肝臟 IMP-9 活性下降，白細胞遷移障礙，最終 IRI 損傷減輕。之，在以上各種因子介導下凋亡壞死的細胞，引發(fā)了肝臟局部的激癥反應，這種反應被逐步放大，對肝細胞造成進一步的損傷[79]，如

圖 3. 肝臟 IRI 中性粒細胞浸潤肝臟組織損傷肝細胞機制，來自參考文獻[88]3. 參與肝臟 IRI 的信號通路1）細胞存活相關(guān)信號途徑肝臟 IRI 涉及細胞存活，細胞損傷后的恢復，免疫細胞的激活，相關(guān)因子的產(chǎn)生釋放等過程，眾多信號分子通路被證實參與其中，共同構(gòu)成分子網(wǎng)絡發(fā)揮重要調(diào)控作用。IR 可以激活 MAPK 途徑下游 p38 和 JNK[89-91]。給予 p38/JNK 激動劑加重肝臟 IRI，而 MAPK 抑制劑的應用則可以減輕IRI [92]。PI3K/Akt 信號通路作為重要的細胞存活信號，在 IRI 中也扮演著重要角色，存活激酶 Akt 可以使凋亡信號途徑中的一系列分子發(fā)生磷酸化，例如 BAD、FOXO、IκB kinase、GSK-3β 等，從而在 IRI 中對細胞起到保護作用[93]。2）炎癥信號通路

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 ;Expression of macrophage inflammatory protein-1αin Kupffer cells following liver ischemia or reperfusion injury in rats[J];World Journal of Gastroenterology;2006年24期

2 Hye-Lin Ha;Hye-Jun Shin;Mark A Feitelson;Dae-Yeul Yu;;Oxidative stress and antioxidants in hepatic pathogenesis[J];World Journal of Gastroenterology;2010年48期

3 Elisa Alchera;Caterina Dal Ponte;Chiara Imarisio;Emanuele Albano;Rita Carini;;Molecular mechanisms of liver preconditioning[J];World Journal of Gastroenterology;2010年48期

本文編號：2816484