【背景】 缺血再灌注損傷(Ischemia reperfusion injury IRI)是指組織器官缺血后再灌注不僅不能改善組織器官功能恢復(fù),反而加重組織器官的功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷。在心肌缺血、腦卒中、創(chuàng)傷等疾病病理過(guò)程中都可發(fā)生IRI。肝臟IRI是肝臟外科最常見(jiàn)的病理過(guò)程,多見(jiàn)于休克、需要阻斷肝臟血流的肝外科手術(shù)以及肝移植術(shù)等病理生理過(guò)程中,研究證實(shí)有10%的早期肝移植失敗都是由于IRI造成,也是引起肝移植術(shù)后急慢性排斥反應(yīng)的重要因素。目前關(guān)于肝臟IRI機(jī)制的研究將該病理過(guò)程分為兩個(gè)階段,早期,多為再灌注后6 h以內(nèi),以氧化應(yīng)激產(chǎn)生大量活性氧族(Reactive oxygen species ROS)直接損傷肝細(xì)胞引起肝細(xì)胞凋亡壞死為主要特征;后期,以炎細(xì)胞浸潤(rùn)釋放大量炎癥相關(guān)因子,進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng),直接或間接引起肝臟細(xì)胞凋亡壞死為特征。 經(jīng)典Notch信號(hào)途徑在進(jìn)化上高度保守,研究證實(shí)Notch信號(hào)途徑廣泛參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞命運(yùn)決定。在哺乳動(dòng)物,經(jīng)典Notch信號(hào)通路由5種配體(Jagged1, 2, and Delta-like [Dll] 1, 3,and 4)和4種受體(Notch1-4)組成,當(dāng)配體與受體結(jié)合,Notch信號(hào)被激活,在??分泌酶(GSI)的酶切作用下,受體胞內(nèi)段?(Notch intracellular domain NICD)被剪切,入核,與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子?RBP-J (recombination signal binding protein J?)?結(jié)合,啟動(dòng)下游基因如包括Hes家族在內(nèi)的堿性螺旋環(huán)螺旋因子的表達(dá),進(jìn)而引發(fā)后續(xù)分子事件。近年有報(bào)道證實(shí),Notch信號(hào)參與了細(xì)胞對(duì)于外界刺激的應(yīng)答,在心、腦缺血性損傷中都有Notch信號(hào)途徑的參與。Notch信號(hào)是否參與肝臟IRI過(guò)程?Notch信號(hào)在肝臟IRI中的作用如何?Notch信號(hào)在肝臟IRI中發(fā)揮作用的分子機(jī)制是什么?這些問(wèn)題的闡明將為IRI相關(guān)的研究開(kāi)辟新的領(lǐng)域,進(jìn)一步完善肝臟IRI分子調(diào)控理論體系,為肝臟IRI的預(yù)防和治療提供理論基礎(chǔ)。 【目的】 研究Notch信號(hào)通路在肝臟IRI中的作用,作用的細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)及分子機(jī)制,探索肝臟IRI新的分子調(diào)控機(jī)制,為肝臟IRI的預(yù)防和治療提供新的理論依據(jù)。 【方法】 1.以無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉小鼠肝臟左葉、中葉血供90 min,制造小鼠肝臟IRI模型,利用Real-time PCR檢測(cè)Notch信號(hào)通路相關(guān)分子在肝臟IRI中的表達(dá)變化,利用Western blot檢測(cè)Notch1受體胞內(nèi)段的表達(dá)水平。 2.利用PCR方法鑒定小鼠基因型,獲得Mx-Cre-RBP-Jf/f純合子小鼠及Mx-Cre-RBP-Jf/+雜合子對(duì)照小鼠,PolyI-PolyC誘導(dǎo),在純合子小鼠中剔除RBP-J基因,實(shí)現(xiàn)阻斷Notch信號(hào)。通過(guò)檢測(cè)血清ALT、AST水平,組織學(xué)HE染色,TUNEL凋亡染色,MPO免疫組織化學(xué),流式細(xì)胞儀檢測(cè)相關(guān)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況,Real-time PCR檢測(cè)炎癥因子表達(dá)水平,觀察阻斷Notch信號(hào)對(duì)肝臟IRI的影響。 3.通過(guò)分別將RBP-J剔除和對(duì)照小鼠全骨髓細(xì)胞移植給致死劑量照射的野生型小鼠,獲得在骨髓細(xì)胞特異剔除RBP-J小鼠及對(duì)照小鼠,行肝臟IRI造模,通過(guò)血清ALT、AST檢測(cè)、組織學(xué)HE染色、TUNEL凋亡染色,觀察骨髓細(xì)胞阻斷Notch信號(hào)對(duì)肝臟IRI的影響。 4.體外應(yīng)用GSI阻斷Notch信號(hào),利用肝細(xì)胞體外缺氧(0.5%)培養(yǎng)15 h,正常培養(yǎng)基常氧培養(yǎng)6 h,模擬IRI,通過(guò)TUNEL凋亡染色,Casepase3 mRNA水平檢,損傷后剩余活細(xì)胞計(jì)數(shù),條件培養(yǎng)基刺激巨噬細(xì)胞后Elisa檢測(cè)TNFα水平,觀察肝細(xì)胞阻斷Notch信號(hào)對(duì)IRI的影響。 5.利用DCFH-DA探針結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平,利用Real-time PCR檢測(cè)iNOS、抗凋亡蛋白Bcl-xl mRNA表達(dá)水平,Western blot檢測(cè)iNOS蛋白表達(dá)水平,觀察阻斷Notch信號(hào)對(duì)肝臟IRI肝細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響,并利用ROS清除劑觀察ROS在Notch信號(hào)調(diào)控肝臟IRI中的作用。 6.利用Real-time PCR檢測(cè)MnSOD mRNA表達(dá)水平,Western blot檢測(cè)MnSOD、磷酸化STAT3、磷酸化Akt蛋白表達(dá)水平,利用免疫共沉淀檢測(cè)Hes5與STAT3蛋白相互作用,通過(guò)過(guò)表達(dá)持續(xù)激活STAT3觀察STAT3在Notch調(diào)控肝臟IRI中的作用,從而揭示Notch信號(hào)通路調(diào)控肝臟IRI中肝細(xì)胞ROS的分子機(jī)制。 7.通過(guò)將肝細(xì)胞與過(guò)表達(dá)Notch配體Dll1 OP-9細(xì)胞共培養(yǎng)或過(guò)表達(dá)Hes5激活Notch信號(hào),觀察激活Notch信號(hào)對(duì)肝細(xì)胞IRI的影響。 【結(jié)果】 1.在肝臟IRI中伴隨著Notch信號(hào)途徑的廣泛激活及下游分子的表達(dá)上調(diào):在肝臟IRI中,Notch1、Notch2、Dll4、Jagged2、Hes5 mRNA表達(dá)上調(diào)、NICD蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。 2.阻斷Notch信號(hào)會(huì)導(dǎo)致肝臟IRI加重。表現(xiàn)為:血清ALT、AST水平升高;肝細(xì)胞凋亡、壞死增加;中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加,炎癥因子TNFα、IL1β、IL6、IFNγ,趨化因子CCL3,粘附分子ICAM1產(chǎn)生增加。 3.阻斷Notch信號(hào)引起肝臟IRI中肝細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增加,并且,應(yīng)用ROS清除劑可以挽救Notch信號(hào)阻斷引起的血清ALT、AST升高,肝細(xì)胞凋亡壞死增加,說(shuō)明Notch信號(hào)阻斷引起肝細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高,最終導(dǎo)致IRI加重。 4.進(jìn)一步分子機(jī)制的研究證實(shí):阻斷Notch信號(hào)導(dǎo)致下游分子Hes5表達(dá)下調(diào)使得Hes5-STAT3復(fù)合物形成障礙,導(dǎo)致STAT3磷酸化水平下降,引起MnSOD表達(dá)下調(diào),最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高,過(guò)表達(dá)持續(xù)激活STAT3可以上調(diào)MnSOD表達(dá),降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平,挽救IRI中Notch信號(hào)阻斷引起的細(xì)胞凋亡增加。 5.體外配體激活Notch或過(guò)表達(dá)Hes5對(duì)肝細(xì)胞IRI起到保護(hù)性作用,表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)ROS水平下降,細(xì)胞凋亡減少。我們的研究結(jié)果說(shuō)明,經(jīng)典Notch信號(hào)途徑通過(guò)其下游分子Hes5協(xié)助STAT3的激活,進(jìn)而引起MnSOD表達(dá)上調(diào),降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平,在IRI中對(duì)肝細(xì)胞起到保護(hù)性作用。 【結(jié)論】 1. Notch信號(hào)通路在肝臟IRI中發(fā)揮重要作用,Notch信號(hào)缺失會(huì)引起肝臟IRI加重。 2.肝細(xì)胞是Notch信號(hào)調(diào)控肝臟IRI的細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ),在骨髓細(xì)胞中阻斷Notch信號(hào)對(duì)肝臟IRI無(wú)明顯影響,肝細(xì)胞中阻斷Notch信號(hào)引起IRI肝細(xì)胞凋亡增加。 3. Notch信號(hào)通過(guò)調(diào)控肝臟IRI中肝細(xì)胞內(nèi)ROS水平影響肝臟IRI,Notch信號(hào)缺失引起肝臟IRI中肝細(xì)胞ROS水平升高。 4. Notch信號(hào)通過(guò)其下游分子Hes5影響STAT3的激活,進(jìn)而調(diào)控MnSOD的表達(dá),最終影響細(xì)胞內(nèi)ROS水平,Notch信號(hào)缺失引起Hes5-STAT3復(fù)合物水平下降,MnSOD表達(dá)下調(diào),ROS清除減少。 5.體外激活肝細(xì)胞Notch信號(hào)對(duì)IRI起到保護(hù)性作用,激活肝細(xì)胞Notch信號(hào)引起IRI細(xì)胞凋亡減少。 眾多細(xì)胞、分子參與了肝臟IRI的調(diào)控,而我們的研究發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)途徑通過(guò)Hes5影響STAT3的激活調(diào)控MnSOD的表達(dá)對(duì)肝臟IRI發(fā)揮保護(hù)性作用。我們首次報(bào)道了Notch-Hes5-STAT3-MnSOD分子調(diào)控軸,開(kāi)辟了肝臟IRI分子調(diào)控機(jī)制研究的新的領(lǐng)域,為肝臟IRI的臨床預(yù)防和治療提供理論基礎(chǔ),同時(shí)也為眾多ROS相關(guān)疾病,如:腫瘤、自身免疫性疾病的相關(guān)研究提供了新的思路。
【學(xué)位單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2011
【中圖分類】：R575
【部分圖文】：

圖 1. 細(xì)胞內(nèi) ROS 的產(chǎn)生和清除機(jī)制② ROS 的損傷作用細(xì)胞內(nèi)蓄積的過(guò)多的 ROS 可以直接損傷細(xì)胞，其損傷機(jī)制包括：（OS 對(duì)細(xì)胞膜雙層磷脂結(jié)構(gòu)中重要脂類進(jìn)行氧化作用，改變膜的完整性和性，生成多種毒性很強(qiáng)的脂質(zhì)過(guò)氧化物，從而直接損傷細(xì)胞；（2）ROS直接氧化肝細(xì)胞核內(nèi) DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)，引起 DNA 突變而造成肝臟結(jié)功能的損傷[54, 55]；（3）ROS 通過(guò)直接作用于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞膜增加血及中性粒細(xì)胞的粘附位點(diǎn)和激活磷脂酶 A2 催化膜表面的磷脂成分產(chǎn)小板激活因子及白三烯，對(duì)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行破壞而損傷肝；（4）ROS 抑制線粒體的氧化磷酸化，使能量物質(zhì)減少；（5）ROS引發(fā)一系列復(fù)雜的生物活性分子的產(chǎn)生和反應(yīng)，如吞噬細(xì)胞激活、內(nèi)毒釋放、補(bǔ)體激活、花生四烯酸代謝激活(生成前列腺素、血栓素)等而造

等在應(yīng)激狀況下都可以表達(dá) iNOS，肝臟 IRI 過(guò)程中 NF-κB 激活下游 iNOS 的表達(dá)[75]。應(yīng)激狀況下 iNOS 產(chǎn)生的 NO 遠(yuǎn)遠(yuǎn)多S, 因此，iNOS 是肝臟 IRI 中 NO 的主要來(lái)源。關(guān)于 NO 在肝臟 I作用尚存在爭(zhēng)議，一方面，NO 具有舒張血管，改善微循環(huán)的作用，肝臟損傷起到保護(hù)性作用[76]。另一方面 NO 在大量氧自由基存在下氧化成過(guò)氧亞硝酸（ONOO-），可以直接使蛋白發(fā)生硝基化，直接損，是效價(jià)很高的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑[77]。此外，Takashi, H. [78]證實(shí)，iNO的 NO 對(duì)于 MMP-9 的活化至關(guān)重要，iNOS 的剔除會(huì)導(dǎo)致肝臟 IMP-9 活性下降，白細(xì)胞遷移障礙，最終 IRI 損傷減輕。之，在以上各種因子介導(dǎo)下凋亡壞死的細(xì)胞，引發(fā)了肝臟局部的激癥反應(yīng)，這種反應(yīng)被逐步放大，對(duì)肝細(xì)胞造成進(jìn)一步的損傷[79]，如

圖 3. 肝臟 IRI 中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)肝臟組織損傷肝細(xì)胞機(jī)制，來(lái)自參考文獻(xiàn)[88]3. 參與肝臟 IRI 的信號(hào)通路1）細(xì)胞存活相關(guān)信號(hào)途徑肝臟 IRI 涉及細(xì)胞存活，細(xì)胞損傷后的恢復(fù)，免疫細(xì)胞的激活，相關(guān)因子的產(chǎn)生釋放等過(guò)程，眾多信號(hào)分子通路被證實(shí)參與其中，共同構(gòu)成分子網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮重要調(diào)控作用。IR 可以激活 MAPK 途徑下游 p38 和 JNK[89-91]。給予 p38/JNK 激動(dòng)劑加重肝臟 IRI，而 MAPK 抑制劑的應(yīng)用則可以減輕IRI [92]。PI3K/Akt 信號(hào)通路作為重要的細(xì)胞存活信號(hào)，在 IRI 中也扮演著重要角色，存活激酶 Akt 可以使凋亡信號(hào)途徑中的一系列分子發(fā)生磷酸化，例如 BAD、FOXO、IκB kinase、GSK-3β 等，從而在 IRI 中對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用[93]。2）炎癥信號(hào)通路

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

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2 Hye-Lin Ha;Hye-Jun Shin;Mark A Feitelson;Dae-Yeul Yu;;Oxidative stress and antioxidants in hepatic pathogenesis[J];World Journal of Gastroenterology;2010年48期

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本文編號(hào)：2816484